[发明专利]一种烟草青枯病快速检测的方法

摘要

本发明涉及一种烟草青枯病快速检测的方法，利用RAPD分子标记技术，以烟草青枯病菌、烟草野火病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌以及荧光假单胞菌和烟草栽培品种云烟87以及中烟100的基因组DNA为模板，筛选烟草青枯病菌的特异片段，将获得的特异片段进行测序分析，再根据特异片段序列设计特异引物，然后完成引物合成，并进行PCR反应，PCR反应体系参数要求为：1μL模板DNA、200μmol/LdNTP、1.5 nmol/L MgCl₂、0.1μmol/L引物、200μmol/L Ex‑Taq DNA polymerase和1×PCRbuffer；PCR扩增条件为：95℃，5 min；94℃，45 s；退火温度40s；72℃，1min；30个循环；72℃，10 min，4℃保存，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

主权项

1.一种烟草青枯病快速检测的方法，其特征在于：1）：利用RAPD分子标记技术，以烟草青枯病菌、烟草野火病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌以及荧光假单胞菌和烟草栽培品种云烟87以及中烟100的基因组DNA为模板，筛选烟草青枯病菌的特异片段，将获得的特异片段进行测序分析，再根据特异片段序列设计特异引物，然后完成引物合成，并进行PCR反应，PCR反应体系参数要求为：1μL模板DNA、200μmol/LdNTP、1.5 nmol/L MgCl₂、0.1 μmol/L引物、200μmol /L Ex‑Taq DNA polymerase和1×PCRbuffer；PCR扩增条件为：95℃，5 min；94℃，45 s；退火温度 40s；72℃，1min；30个循环；72℃，10 min，4℃保存，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；2）：青枯菌菌液最低检出浓度的测定将青枯菌置于28 ℃摇床上过夜培养，以1 mL OD600=1.0的细菌悬浮液中青枯菌数量为109个细菌的标准，梯度稀释细菌悬浮液，形成10⁹ cfu/mL、10⁸ cfu/mL、10⁷ cfu/mL、10⁶ cfu/mL、10⁵ cfu/mL、10⁴ cfu/mL、10³ cfu/mL、10² cfu/mL以及10 cfu/mL梯度细菌悬浮液；同时以青枯菌基因组DNA为模板，模板浓度为42 ng/μL，并将模板进行10、10²、10³、10⁴、10⁵倍稀释，分别吸取1μL菌液或DNA为模板，利用筛选出的特异性引物进行PCR扩增，并进行电泳检测，PCR反应体系和程序如1）；土壤中青枯菌最低检出量的测定将青枯菌置于28℃摇床上过夜，以OD₆₀₀=0.5的细菌悬浮液中青枯菌数量为3×10⁸ cfu/mL的标准，梯度稀释到3×10⁷cfu/mL、3×10⁶cfu/mL、3×10⁵cfu/mL、3×10⁴cfu/mL；分别吸取1ml菌液加入5g已灭菌的土壤中，过夜培养；称取0.2g土壤提取总DNA，稀释50倍作为模板，利用筛选出的特异引物进行PCR扩增；剩余部分加入45ml水摇床摇10分钟，混匀后静置，吸取1μL上清做模板进行PCR；PCR反应体系和程序如1）；3）采用伤根灌根法，每株烟苗灌菌悬液10 mL，设置3个重复，每个重复接种5株烟苗，以清水为对照处理，于接种后7d取样，利用特异引物扩增检测土壤和烟株体内青枯病菌的含量；利用RAPD分子标记技术，筛选出烟草青枯病菌的特异片段6个，测序结果表明，这6个片段分别代表不同的基因序列，其片段大小和靶基因名称如下：片段名称：A1，大小373bp，靶基因：DUF29 domain‑containing protein；片段名称：A6，大小1140bp，靶基因：conserved exported protein of unknown function；片段名称：A7，大小1153bp，靶基因：sensor histidine kinase；片段名称：S6，大小240bp，靶基因：tRNA‑Tyr；片段名称：S13，大小875bp，靶基因：putative aldehyde dehydrogenase protein；片段名称：S18，大小783bp，靶基因：Ribosome hibernation promoting factor；4）根据特异片段序列设计特异引物，共筛选出特异性扩增烟草青枯病菌的引物6对，6对引物分别为：引物名称A1，序列F：5' GAGCGAACAGCGGGAGTTG 3'，R：5' TCCCGACGCTGGACGCAAA 3'；PCR扩增退火温度：62，扩增片段长度：373 bp；引物名称A6，序列F：5' GCTGTTTCGTCTGCGTGGG 3'，R：5' GCGACCTCCAGAAACGAAA 3'；PCR扩增退火温度：60.4，扩增片段长度：1140bp；引物名称A7，序列F：5' ACCTGTTCCAGCAAGGCAT 3'，R：5' CGACAGATACGCGACAAATAAT 3'；PCR扩增退火温度：61.4，扩增片段长度：1153bp；引物名称S6，序列F：5' CTGCCCGTTAGGGCGTCT 3'，R：5' TTAGCCACTCGGGCACCT 3'；PCR扩增退火温度：54.6，扩增片段长度：240bp；引物名称S13，序列F：5' TCCTCCGCTTGTGACGCC 3'，R：5' CCCACTGCAAGTGATGCT 3'；PCR扩增退火温度：54.6，扩增片段长度：875bp；引物名称S18，序列F：5' TCCCAGCAGTGAATCTGCG 3'，R：5' GCAATGCGTGAAATGAGCG 3'；PCR扩增退火温度：58.9，扩增片段长度：783bp；利用筛选出的特异引物对，分别以烟草青枯病菌不同稀释度的菌液和基因组DNA为模板进行PCR扩增；对于基因组DNA，引物对A1F/R、A6F/R、A7F/R、S6F/R、S13F/R、S18F/R检测的灵敏度均达到10⁵的稀释度，即0.42 pg/μL；对于青枯病菌菌液，引物对A1F/R、A6F/R、A7F/R、S13F/R能检测到的最低浓度为10⁵ cfu/mL，引物对S6F/R、S18F/R能检测到的最低浓度为10⁶ cfu/mL；分别从每克土含菌量为1.2×10⁷ cfu、1.2×10⁶ cfu、1.2×10⁵ cfu、1.2×10⁴ cfu、1.2×10³ cfu的土壤中提取总DNA，并以稀释50倍的DNA为模板进行特异引物的PCR扩增，利用特异引物对S13扩增检测的青枯菌最低含量为每克土含菌量为6×10²cfu；对于土壤悬浮液，特异引物对S13检测的最低浓度为102稀释度，即3×10⁶cfu/mL；其他5对特异引物的扩增结果与S13引物一致；5）接种青枯病菌后7d，分别取不同发病程度的烟株和根际土壤，利用特异引物进行PCR扩增，接种的烟株根际土壤和发病较重的烟株中都能扩增出青枯病菌的特异条带，而健康和轻微发病的烟株中未检测出青枯病菌。