[发明专利]一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法在审
| 申请号： | 201910202040.7 | 申请日： | 2019-03-18 |
| 公开（公告）号： | CN109734802A | 公开（公告）日： | 2019-05-10 |
| 发明（设计）人： | 徐秀龙;冯雪冰;孙敬 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C07K16/10 | 分类号： | C07K16/10;C12N15/70;C07K14/005;G01N33/569 |
| 代理公司： | 扬州苏中专利事务所(普通合伙) 32222 | 代理人： | 沈志海 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法，首先设计特异性的引物，得到重组表达载体PcoldI‑N、PcoldI‑S，转入大肠杆菌Rosseta后，经IPTG诱导获得重组蛋白；利用亲和柱对重组蛋白进行纯化；以纯化的重组蛋白作为免疫原，取6‑8周龄Balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与S/P20细胞融合，利用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选出阳性杂交瘤细胞株；将筛选出的阳性杂交瘤细胞株经过三次亚克隆，得到3株抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株；将3株抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株分别注入小鼠腹腔，收获腹水并进行纯化，最终获得了具有高纯度高特异性的抗PEDV单克隆抗体。通过本发明，能够获得了具有高纯度高特异性的抗PEDV单克隆抗体。 | ||
| 搜索关键词： | 单克隆抗体 重组蛋白 阳性杂交瘤细胞株 猪流行性腹泻病毒 特异性杂交 瘤细胞株 高纯度 制备 间接酶联免疫吸附 免疫小鼠脾细胞 重组表达载体 大肠杆菌 筛选 雌性小鼠 次亚克隆 免疫程序 细胞融合 小鼠腹腔 免疫原 亲和柱 腹水 引物 转入 收获 | ||
【主权项】：
1.一种重组猪流行性腹泻病毒N、S蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征是，包括以下步骤：（1）根据GenBank中已发表的猪流行性腹泻病毒N、S基因序列设计特异性的引物，通过PT‑PCR方法扩增N、S基因，测序鉴定正确后克隆到原核表达载体PcoldI上，得到重组表达载体PcoldI‑N、PcoldI‑S；（2）将步骤（1）得到的重组表达载体PcoldI‑N、PcoldI‑S转入大肠杆菌Rosseta后，经IPTG诱导获得重组蛋白；（3）利用亲和柱对重组蛋白进行纯化，并用Western‑Blot鉴定分析所获得的重组蛋白，结果表明表达的重组蛋白具有反应原性；（4）以纯化的重组蛋白作为免疫原，取6‑8周龄Balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，取免疫小鼠脾细胞与S/P20细胞融合，利用间接酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选出阳性杂交瘤细胞株，同时用重组蛋白包被酶标板，建立了间接ELISA检测单抗的方法；（5）将经步骤（4）筛选出的阳性杂交瘤细胞株经过三次亚克隆，得到3株抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株，分别命名为：4B8、4C10、3C3；对获得的抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株进行Western‑Blot鉴定分析，结果表明该3株抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株均能与PEDV全病毒发生特异性反应；（6）将3株抗PEDV N蛋白特异性杂交瘤细胞株分别注入小鼠腹腔，收获腹水并进行纯化，最终获得了具有高纯度高特异性的抗PEDV单克隆抗体。
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