[发明专利]一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法

摘要

本发明涉及一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，用盐酸调节破碎后的细菌发酵培养液pH值至酸性，静置后，离心取上清，将上清超滤浓缩后，分别加入沉淀剂和籽晶，混合均匀后放入控温箱中直至晶体析出，清洗晶体三次后，继续结晶两次以上后，冷冻干燥，得到成品。该方法不仅过程简单，成本低，而且不使用任何层析技术，避免了层析技术的缺陷。该方法在得到高纯度超氧化物歧化酶的同时，还获得了超氧化物歧化酶晶体。得到的超氧化物歧化酶纯度达到96％，比活力为4523U/mg。因此，该方法既是一种可替代层析法的新型分离纯化技术，还提供了一种制备超氧化物歧化酶晶体的方法，具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种利用结晶法分离提纯超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步骤如下：步骤1：利用超声破碎仪将细菌发酵培养液破碎后，离心取上清，用盐酸调节蛋白质溶液pH值至酸性，0℃–4℃静置1h–3h后，离心取上清，超滤浓缩后得到蛋白质溶液；步骤2：将沉淀剂溶解在0.1–5mM，pH值为3.0–5.5的柠檬酸溶液中，与蛋白质溶液按1:1体积比混合后，加入10–200μL籽晶，置于控温箱中，在4℃–20℃中搅拌结晶；所述沉淀剂为PEG8000，浓度为20–80mg/mL；步骤3：将结晶完成后的溶液离心后取沉淀，所得沉淀即为超氧化物歧化酶晶体混合物；步骤4：加入超氧化物歧化酶晶体清洗溶液，缓慢搅拌混匀后，离心弃上清，重复该过程多次以彻底清洗晶体，得到超氧化物歧化酶晶体；所述晶体清洗溶液为20–100mg/mL的PEG8000溶液；步骤5：将所得晶体冻干，得到白色粉末状超氧化物歧化酶成品，或不冻干，直接作为晶体制剂应用。