[发明专利]大熊猫IgG Fc片段的原核表达及其多克隆抗体制备的方法

摘要

本发明公开了大熊猫IgG Fc片段的原核表达及其多克隆抗体制备的方法，首次选用原核表达系统表达大熊猫IgG Fc恒定区，用构建好的含有大熊猫IgG Fc片段基因的重组载体pMAL‑C4x‑PFc转化DH5α菌，提取质粒用BamH I和Hind III酶切鉴定后转化BL21菌，经过诱导条件的优化，成功实现大熊猫IgG Fc片段的大量可溶性表达，用亲和层析法分离得到较纯的重组蛋白；将亲和层析获得的较纯可溶性重组蛋白与弗氏佐剂充分乳化后3次免疫健康小鼠，3次免疫1周后采集鼠血清，用间接ELISA测多克隆抗体效价非常高，成功制备了效价高、稳定性好的大熊猫多克隆抗体。

主权项

1.一种大熊猫IgG Fc片段(PFc)的原核表达方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建重组表达载体：将PFc插入pMAL‑C4x载体的BamH I和Hind III酶切位点之间，得到pMAL‑C4x‑PFc重组载体；(2)重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌，将步骤(1)中得到的pMAL‑C4x‑PFc重组载体与培养的DH5α菌进行混合培养，获得了表达PFc的重组DH5α菌；(3)重组质粒的提取：氨苄抗性筛选步骤(2)中得到的重组DH5α菌，培养氨苄抗性筛选后的重组DH5α菌至OD600值达到0.6‑0.8，使用试剂盒提取培养后的重组DH5α菌的重组质粒，得到pMAL‑C4x‑PFc重组质粒；(4)重组质粒转化甘油菌BL21菌：将步骤(3)中得到的pMAL‑C4x‑PFc重组质粒与培养的BL21菌进行混合培养，获得了重组BL21菌；(5)重组BL21菌的诱导表达：氨苄抗性筛选步骤(4)中得到的重组BL21菌并且进行培养至OD600值达到0.6‑0.8，使用诱导剂诱导表达培养后的重组BL21菌，离心后使用蛋白纯化结合平衡缓冲液重悬沉淀，超声破碎重悬后的重组BL21菌菌体至菌液具有透光性，得到表达的重组蛋白。