[发明专利]一种脑心通制剂中全蝎药材的DNA分子鉴别方法

摘要

本发明公开了脑心通制剂中全蝎药材的DNA分子鉴别方法。该方法采用蛋白酶K消化动物药组分，以广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取植物组分。基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)设计全蝎特异性引物进行PCR扩增；产物经电泳测序，所得序列在GenBank数据库中应用BLAST进行结果判定，以相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。本发明所使用的特异性引物可扩增约250bp的小片段基因，不受全蝎的外在形态限制，能对含全蝎粉末中药制剂，特别是脑心通胶囊进行鉴定，避免了DNA降解造成的影响，具有准确、通用的特点。提高了动物全蝎药材的质量控制水平，进一步完善了脑心通胶囊的质量标准。

主权项

1.一种脑心通制剂中全蝎药材的DNA分子鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：(1)脑心通制剂总DNA的提取：先用蛋白酶K消化其中的动物组分，再按广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒说明提取植物组分，得总DNA的提取物；(2)PCR扩增：步骤(1)所得总DNA提取物为模板，稀释浓度为50.00±0.50ng/μL，用量0.5μL‑1.0μL，10×PCR缓冲液1.5μL，25mM MgCl₂溶液1.5μL，2.5mM dNTPs 1.2μL，全蝎特异性引物：10μM的特异性正向引物和10μM的特异性反向引物各0.75μL，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.1μL，加ddH₂O补足至总体系为15μL；PCR扩增反应程序为：95℃ 3min；95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 1min，39个循环；72℃ 5min；所述的全蝎特异性引物包括2个引物对，序列如下：COI MM F1/R1引物对:COI MM F1：5’‑CAGGTTTATAATGTTGTGGTG‑3’，COI MM R1：5’‑GCCAAAGAAGAAGATAAAGGC‑3’，扩增片段长度为257bp；COI MM F2/R4引物对:COI MM F2：5’‑TATTATAATTGGTGGATTTGGG‑3’，COI MM R4：5’‑AAAATTGAAGACACCCCAGCT‑3’，扩增片段长度为261bp；(3)电泳检测及测序：取步骤(2)所得的PCR产物与6×RNA/DNA Loading buffer混合，电泳，得单一明亮条带，纯化后测序；(4)鉴定：步骤(3)中测得的序列在GenBank数据库中应用BLAST方法进行对比，相似性最高的序列对应物种为待测样品最接近的物种。