[发明专利]一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法

摘要

本发明公开的一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，属于分析检测领域。利用磁珠介导在样品中实现特异性分离，不需要样品前处理。磁珠表面定量连接待测目标物的适配体，实现自适应超高灵敏一体化检测技术，可以实现高通量标准化的检出模式。新型选择性定位探针，实现对目标序列的可编程的任意位点剪切，可以通过凝胶电泳/核酸体外扩增完成整个检测分析过程。将被剪切下的目标片段直接通过凝胶电泳测定，或进行体外扩增，根据实时检测信号的出峰时间进行浓度测量，且本发明方法在复杂的人体体液样本中检测效果良好，可以成功检测浓度低达10

主权项

1.一种基于新型定位探针的一体化高灵敏检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n 1)通过磁珠介导在磁珠表面修饰核酸适配体；所述核酸适配体用于特异性结合目标物；所述核酸适配体为寡核苷酸序列，核酸适配体的碱基序列为：ACGGTTGCAAGTGGGACTCTGGTAGGCTGGGTAATTTGG；/n 2)将修饰好的磁珠-核酸适配体溶液与被测样品混合孵育，并进行提取磁分离；所述的被测样品为甲基苯丙胺；/n 3)孵育后利用新型定位探针进行介导剪切，所述选择性定位探针的序列为CCAAATTACCCAGCCTACCAGACTCACGTTTTTCGTGAGT；加入限制性核酸内切酶，将未与样品结合的核酸适配体的目标片段剪切下来并进行检测磁分离；所述的新型定位探针为非对称发卡状DNA；没有3’端的侧臂，且3’端的茎上缺少一个碱基；茎上含有限制性核酸内切酶的不完整识别位点；当核酸适配体与目标物结合时呈核壳结构，所述新型定位探针无法与核酸适配体结合；未与目标物结合的核酸适配体呈初始线形结构，在特定位置将暴露碱基；所述不完整识别位点即可与核酸适配体利用碱基互补配对形成完整的识别序列；在限制性核酸内切酶的作用下快速剪切核酸适配体，获得所需的目标片段；所述的限制性核酸内切酶为切口内切酶Nt.BstNBI；/n4)将被剪切下的目标片段进行体外扩增，根据实时荧光的信号出峰时间进行浓度检测，剪切得到的目标片段浓度越大，出峰时间越短。/n