[发明专利]一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法

摘要

本发明公开了一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法，采用胰蛋白酶对母乳进行酶解，选择母乳中抗体酶解产生的多肽中的特异性多肽作为标志物，人工合成该特异性多肽作为标准物质，设计并合成同位素标记的特异性多肽作为内标，采用同位素稀释液相色谱串联质谱法对特异性多肽进行定量检测，然后换算得母乳中抗体的含量。本发明能同时定量检测母乳中三种抗体含量，稳定性好、定量准确、重复性好、特异性高。

主权项

1.一种同时定量检测母乳中三种抗体含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)样品预处理母乳样品混合人工合成的同位素标记特异性多肽混标，并经胰蛋白酶酶解后得预处理液；同位素标记特异性多肽混标为同位素标记IgA特异性多肽、同位素标记IgG特异性多肽及同位素标记IgM特异性多肽的混合物；同位素标记特异性多肽混标中各同位素标记特异性多肽的浓度均为20μg/mL；IgA特异性多肽序列为：SAVQGPPER；IgG特异性多肽序列为：VVSVLTVLHQDWLNGK；IgM特异性多肽序列为：QIQVSWLR；同位素标记IgA特异性多肽序列为：SAV*QGPPER；同位素标记IgG特异性多肽序列为：V*VSVLTVLHQDWLNGK；同位素标记IgM特异性多肽序列为：QIQV*SWLR；V*代表同位素标记缬氨酸；(2)标准曲线制作取梯度浓度的人工合成的特异性多肽混标各10μL，分别加入人工合成的同位素标记特异性多肽混标10μL及980μL水；通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，同时获得IgA抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgA抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgG抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgG抗体标准品溶液浓度的标准曲线、IgM抗体特异肽和同位素特异肽的峰面积比与对应的IgM抗体标准品溶液浓度的标准曲线；(3)色谱串联质谱分析预处理液通过0.22μm滤膜后上高效液相色谱串联三重四级杆质谱检测，得到的结果代入标准曲线，从而获得母乳样品中IgA特异性多肽、IgG特异性多肽、及IgM特异性多肽的浓度；母乳样品中IgA抗体浓度＝样品中IgA特异性多肽的摩尔浓度×IgA抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2，母乳样品中IgG抗体浓度＝样品中IgG特异性多肽的摩尔浓度×IgG抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2母乳样品中IgM抗体浓度＝样品中IgM特异性多肽的摩尔浓度×IgM抗体摩尔质量×母乳样品稀释倍数/2。