[发明专利]一种固定化赖氨酸脱羧酶生产戊二胺的方法

摘要

本发明公开了一种固定化赖氨酸脱羧酶生产戊二胺的方法。该方法通过将几丁质结合域（ChBD）基因接至赖氨酸脱羧酶基因（CadA）N端构建得融合蛋白，并将该融合蛋白发酵得赖氨酸脱羧酶粗酶液，再向粗酶液中加入几丁质，即得固定化的赖氨酸脱羧酶，最后将所得固定化酶参与L‑赖氨酸的脱羧反应制备1，5‑戊二胺。本发明巧妙利用底物几丁质与融合蛋白的特异性亲和作用来吸附赖氨酸脱羧酶，固定化载体几丁质成本低廉，固定化效率高，酶的活力稳定性较好，同时特异性的亲和吸附可省去蛋白纯化的步骤。本发明提供一种重复生产1，5‑戊二胺的方法，可降低成生产成本并简化下游产品与酶的分离步骤，具有显著的经济效益。

主权项

1.一种固定化赖氨酸脱羧酶生产戊二胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，融合蛋白质粒的构建提取赖氨酸脱羧酶基因CadA与几丁质结合域基因ChBD基因，以连接转化方法将所得基因片段在空质粒pET‑29a(+)中依次连接上ChBD基因和CadA基因，其中ChBD基因连接在CadA基因的N端，完成质粒pET‑29a（+）‑Chbd‑Cada构建后，转入克隆载体Trans1‑T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序，并将测序正确的菌株培养、提质粒后，转化进表达载体BL21（DE3），即得含有赖氨酸脱羧酶融合蛋白的基因工程菌；步骤2，赖氨酸脱羧酶粗酶液的制备培养含有赖氨酸脱羧酶融合蛋白的基因工程菌，将种子液以体积分数1%‑5%接种量接入LB培养基中，37℃下培养至菌密度OD₆₀₀为0.4‑0.6时，加入诱导剂诱导12‑14h后收集发酵液，再在低温离心机进行6000‑8000g离心，收集菌株，用蒸馏水洗涤2‑5次后破碎细胞，低温离心机6000‑8000g离心后收集上清，即得赖氨酸脱羧酶粗酶液；步骤3，赖氨酸脱羧酶与几丁质的亲和吸附向赖氨酸脱羧酶粗酶液中加入质量分数为1‑4%的几丁质，4‑37℃、100‑400rpm下搅拌，再调节pH至5.6‑8.0,亲和吸附10‑120min，即得固定化酶；步骤4，1，5‑戊二胺的生产将固定化酶从粗酶液中分离出来，加入底物赖氨酸盐酸盐与辅酶磷酸吡哆醛，42℃下，200‑400rpm的搅拌速度进行转化反应2‑5小时后得戊二胺转化液，并回收转化液中的固定化酶，备用；所述底物赖氨酸盐酸盐浓度为100g/L‑200g/L，辅酶磷酸吡哆醛浓度为0.05‑0.2mM。