[发明专利]改造宿主细胞基因组的方法及其用途

摘要

本发明提供了一种在宿主细胞基因组的指定位点整合多种外源基因的方法。本发明还提供了一种改造宿主细胞基因组的方法，所述方法包括：a.在宿主细胞基因组的指定位点整合外源基因；和/或b.在宿主细胞基因组中敲除岩藻糖转移酶8基因和/或谷氨酰胺合成酶基因和/或α2,3‑唾液酸转移酶基因4和/或α2,3‑唾液酸转移酶基因6。本发明还提供了根据本发明的方法制备的宿主细胞。本发明还提供了所述宿主细胞用于生产目的蛋白的用途。本发明提供的CHO株的细胞基因组中定点整合了能够提高蛋白表达的基因，对于开发新型抗体和高端仿制抗体，有着重要的意义。

主权项

1.一种在宿主细胞的指定位点整合多种外源基因的方法，所述方法包括以下步骤：/n1)制备“锚定”的宿主细胞，所述“锚定”的宿主细胞包含位点特异性重组酶识别序列LoxPwt、LoxP1和PGK启动子驱动的正筛选序列；/n优选地，所述正筛选序列为Puro-T2A-d1EGFP，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；/n优选地，所述“锚定”的宿主细胞通过打靶载体获得，所述打靶载体含有指定位点的同源左右臂、位点特异性重组酶识别序列LoxPwt、LoxP1和正负筛选序列；/n更优选地，所述打靶载体依次含有GAPDH同源左臂、Zeocin-T2A-TK的正负筛选序列、Puro-T2A-d1EGFP的正筛选序列，Cre-LoxP系统中的位点特异性重组酶识别序列LoxPwt和LoxP1、GAPDH同源右臂和白喉霉素A链(DTA)的负筛选序列，优选地，其部分DNA序列如序列如SEQ ID NO:10所示；/n2)制备含有外源基因的定点整合载体系列，其中包括：/n第一定点整合载体，其使用第一载体制备，包含第一外源基因，第一抗生素抗性基因、位点特异性重组酶识别序列LoxPwt、LoxP4和LoxP2；/n第二定点整合载体，其使用第二载体制备，包含第二外源基因，第二抗生素抗性基因、位点特异性重组酶识别序列LoxPwt、LoxP1和LoxP5；/n任选地，第三定点整合载体，其使用第一载体制备，包含第三外源基因，第一抗生素抗性基因、位点特异性重组酶识别序列LoxPwt、LoxP4和LoxP2；/n任选地，第四定点整合载体，其使用第二载体制备，包含第四外源基因，第二抗生素抗性基因、位点特异性重组酶识别序列LoxPwt、LoxP1和LoxP5；/n任选地，根据拟整合的基因制备相应的载体；/n3)使用第一定点整合载体转染宿主细胞，并用第一抗生素筛选出第一抗生素抗性、第二抗生素敏感的克隆；/n4)使用第二定点整合载体转染步骤3)得到的克隆，并用第二抗生素筛选出筛选出第二抗生素抗性、第一抗生素敏感的克隆；/n5)任选地，使用第三定点整合载体转染步骤4)得到的克隆，并用第一抗生素筛选出第一抗生素抗性、第二抗生素敏感的克隆；/n6)任选地，使用第四定点整合载体转染步骤5)得到的克隆，并用第二抗生素筛选出筛选出第二抗生素抗性、第一抗生素敏感的克隆；/n7)任选地，根据拟整合的基因制备相应的载体依次整合，得到在指定位点整合多种基因的宿主细胞；/n优选地，所述第一抗生素抗性基因和第二抗生素抗性基因分别选自以下的两个：/n潮霉素B基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素基因、杀稻瘟菌素基因、腐草霉素基因。/n优选地，所述第一抗生素抗性基因和/或第二抗生素基因还通过自动切割肽段连接示踪蛋白的基因序列；/n优选地，所述示踪蛋白选自d1EGFP或DsRed-E2；/n优选地，所述第一定点整合载体按排列顺序依次是：重组酶识别序列LoxPwt、不带启动子的抗性基因HygB序列或HygB-T2A-DsRed-E2序列、重组酶识别序列LoxP4、人延长因子1a(EF1a)启动子、第一外源基因和重组酶识别序列LoxP2；/n优选地，所述第二定点整合载体按排列顺序依次是：重组酶识别序列LoxPwt、不带启动子的抗性基因Puro序列或Puro-T2A-d1EGFP序列、重组酶识别序列LoxP1、人延长因子1a(EF1a)启动子、第二外源基因和重组酶识别序列LoxP5；/n优选地，所述第三定点整合载体按排列顺序依次是：重组酶识别序列LoxPwt、不带启动子的抗性基因HygB序列或HygB-T2A-DsRed-E2序列、重组酶识别序列LoxP4、人延长因子1a(EF1a)启动子、第三外源基因和重组酶识别序列LoxP2；/n优选地，所述第四定点整合载体按排列顺序依次是：重组酶识别序列LoxPwt、不带启动子的抗性基因Puro序列或Puro-T2A-d1EGFP序列、重组酶识别序列LoxP1、人延长因子1a(EF1a)启动子、第四外源基因和重组酶识别序列LoxP5；/n优选地，所述第一载体和第二载体分别选自质粒载体pBR322、pUC57、pBluescript、pCI-neo、pcDNA3.1；优选地，所述第一载体和第二载体分别为pTOG3和pTOG4；其中，所述载体pTOG3核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述载体pTOG4核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；/n优选地，将两种或更多种基因的序列用自动切割肽段连接作为任选的外源基因；将另外的两种或更多种基因的序列用自动切割肽段连接作为另一任选的外源基因；/n更优选地，所述自动切割肽段选自P2A、T2A或E2A；更优选地，所述自动切割肽段为P2A，进一步优选地，其序列如SEQ ID NO:16所示：SEQ ID NO:16：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP。/n