[发明专利]一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼

摘要

一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，该斑马鱼获得方法包括如下步骤：CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计构建表达载体以及体外合成；斑马鱼胚胎的显微注射；T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；注射两个月之后，进行剪尾鉴定；目的序列的TA克隆；质粒的Sanger测序；获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代；获得斑马鱼突变体的F2代纯合子；依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系；筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼；筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。

主权项

1.一种小片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，其特征在于，该斑马鱼获得方法包括如下步骤：步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，靶点的选择遵循此标准：5'‑GG‑(N)18‑NGG‑3'：其中5'端的二核普酸是T7启动子的一部分,靶位点的3'端是NGG；步骤二、构建表达载体以及体外合成步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射在受精30min后之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；在进行显微注射之前,将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内,注射过的受精卵放置于置于5mmol/L NaCl、0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在体视显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,使用T7E1对纯化回收DNA目的片段按一定的比例进行酶切实验，检测目的DNA片段是否被切开；如若目的DNA片段下面有被切开的条带，则使用ImageJ软件，通过酶切后条带的亮度来估计非同源末端连接的频率；这样可以检测其stat1a基因是否存在突变，提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范；另外，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，则说明注射F0代的斑马鱼有突变的情况出现，进一步确认了靶位点及此次注射的有效性，接下来将剩余的斑马鱼胚胎养大成成鱼即可进行F0代突变体筛选工作；步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定；步骤六、目的序列的TA克隆T7E1酶切初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序：若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行克隆之后挑取单克隆作进一步检测；步骤七、质粒的Sanger测序将双酶切检测结果显示条带中目的条带有被切开的质粒送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到后代；步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代, 放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalI限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子；如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；步骤十、依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系；步骤十一、筛选stat1b基因突变缺失型斑马鱼根据筛选stat1a基因突变缺失型斑马鱼同样的步骤，同样对stat1b基因进行CRISPR/Cas9基因敲除，通过筛选，获得stat1b基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1b‑S2的斑马鱼纯合品系；步骤十二、筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼将stat1a‑17 F5代突变纯合体斑马鱼与stat1b‑S2 F3代突变纯合体斑马鱼进行杂交，依据步骤八、步骤九的方法最终获得stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼纯合品系。