[发明专利]一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼

摘要

一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，其获得方法包括如下步骤，CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计；构建表达载体以及体外合成；斑马鱼胚胎的显微注射；T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；注射两个月之后，进行剪尾鉴定；目的序列的TA克隆；质粒的Sanger测序；获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代；获得斑马鱼突变体的F2代纯合子；依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系；筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。

主权项

1.一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，其特征在于，其获得方法包括如下步骤，步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计；在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，步骤二、构建表达载体以及体外合成；步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射；在受精成功30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；在进行显微注射之前,将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9 mRNA的终浓度为300ng/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL，注射1.8nLCas9 mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内,注射过的受精卵置于5mmol/L NaCl、0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在体视显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,检测其stat1a基因是否存在突变；将纯化回收后的DNA进行T7核酸内切酶Ⅰ酶切；步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定；将斑马鱼单条成鱼进行剪尾，剪其尾鳍1/3到1/2，后加入裂解液400μL和蛋白酶K2μL，55℃水浴，进行裂解释放DNA，时间不要超过12小时；然后进行基因组提取，PCR后纯化回收；步骤六、目的序列的TA克隆；经T7E1酶切显示斑马鱼基因条带被切成两条带或两条以上，初步鉴定目的序列有突变可能，再进行Sanger测序：若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行克隆之后挑取单克隆作进一步检测；步骤七、质粒的Sanger测序；检测结果显示为在目的片段大小位置有亮带出现的质粒，即为符合预期结果，将其送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；步骤八、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代；通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率；受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR扩增出700bp的靶位点附近区域，再进行T7E1酶切分析并送部分去测序，确定此突变是否可以遗传到后代；步骤九、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子；从F1代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代,放置于28℃培养，受精四天后取部分胚胎进行鉴定；将每个胚胎单独提取基因组,PCR扩增出700bp靶位点附近区域，通过BalI限制性酶切分析并测序，初步检验是否可以得到stat1a突变体纯合子；如检验结果证明存在纯合子，则养大后再单条剪尾鉴定；步骤十、依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系；通过以上相同步骤，利用CRISPR/Cas9基因敲除技术对stat1b基因进行敲除，获得stat1b基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1b‑S3的斑马鱼大片段缺失纯合品系；步骤十一、筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼将stat1a‑17 F5代突变纯合体斑马鱼与stat1b‑S3 F3代突变纯合体斑马鱼进行杂交，依据步骤八、步骤九的方法最终获得stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼纯合品系。