[发明专利]一种包涵体蛋白的纯化方法及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，提供一种包涵体蛋白的纯化方法及其应用。纯化方法主要是全程使用一种经实验确定的溶解包涵体的缓冲液（10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mMβ‑巯基乙醇）及相关洗杂液、洗脱液，纯化完成后通过透析的方法将尿素、咪唑最终去除，对获得的纯蛋白进行体外酶活性测定、体内接种致病性测定等，显示所获纯蛋白Pl101具较高酶活性及致病性。本发明方法快速、简便、有效地获得具生物学活性的目标蛋白，降低了纯化成本。

主权项

1.一种包涵体蛋白Pl101的纯化方法及其应用，其特征在于，包涵体蛋白Pl101的纯化方法包括有下列步骤：A：将靶基因Pl101构建原核表达体系（表达载体pET‑28a），转化大肠杆菌（表达菌株E. coli BL21 (DE3) pLysS）诱导表达出融合蛋白Pl101，确定的包涵体蛋白诱导表达条件为：诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为1mM/L，诱导时间16h；B：实验表明表达出的融合蛋白Pl101在常规缓冲液（10mM Tris‑HCl pH7.0，150mM NaCl）中不可溶，即上述方法表达出的融合蛋白Pl101为包涵体，经实验确定可将包涵体溶解的缓冲液A为10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，10mM咪唑，5mM β‑巯基乙醇；C：对在缓冲液A中溶解的融合蛋白Pl101进行亲和层析纯化，亲和层析介质为Ni‑NTA琼脂糖凝胶，并对洗杂液、洗脱液进行不同条件的优化，经实验确定的三种洗杂液分别为缓冲液B（10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β‑巯基乙醇）、C（10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl, 2M尿素，20mM咪唑，5mM β‑巯基乙醇、0.5%(v/v)吐温‑20）、D（10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，20mM咪唑，5mM β‑巯基乙醇、0.5%(v/v)乙醇），洗脱液为缓冲液E（10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl，2M尿素，100mM咪唑，5mM β‑巯基乙醇），即缓冲液A组份纯化全程使用以防蛋白沉淀，经透析袋4℃低温透析的方法将最终缓冲液替换为10mM Tris‑HCl pH10.3，150mM NaCl，5mM β‑巯基乙醇，将尿素、咪唑完全去除，获得纯蛋白Pl101，纯蛋白经Western blotting杂交验证。