[发明专利]一种Pull-down鉴定污染物分子靶点的方法在审
| 申请号： | 201910290115.1 | 申请日： | 2019-04-11 |
| 公开（公告）号： | CN110045128A | 公开（公告）日： | 2019-07-23 |
| 发明（设计）人： | 陈联国;孙玉苗;胡陈艳 | 申请（专利权）人： | 中国科学院水生生物研究所 |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68;G01N33/50 |
| 代理公司： | 武汉宇晨专利事务所 42001 | 代理人： | 王敏锋 |
| 地址： | 430072 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种鉴定污染物分子蛋白靶点的方法，步骤是：(1)将污染物的结构进行修饰，将污染物固定在琼脂糖微珠上形成复合物；(2)将待测样品组织裂解液与复合物共同孵育，使蛋白吸附到复合物上；(3)清洗复合物，去除与污染物非特异性结合的蛋白杂质；(4)通过复合物与上样缓冲液共孵育，释放污染物结合蛋白；(5)通过分离蛋白条带，切胶，并进行胶内还原、酰化和酶切处理，回收多肽条段；(6)污染物结合蛋白的多肽条段通过鸟枪法蛋白质组质谱分析，确定污染物特异性结合的靶点蛋白。此方法简单易行，操作方便，可直接从组分复杂的组织裂解液中寻找污染物的分子结合靶蛋白。通过后期不同验证手段可保证靶点筛选结果的可靠性。 | ||
| 搜索关键词： | 污染物 复合物 污染物分子 组织裂解液 结合蛋白 靶点 多肽 条段 非特异性结合 琼脂糖微珠 上样缓冲液 特异性结合 靶点蛋白 靶点筛选 待测样品 蛋白吸附 蛋白杂质 蛋白质组 分离蛋白 分子结合 质谱分析 靶蛋白 共孵育 鸟枪法 种鉴定 孵育 酶切 切胶 去除 条带 修饰 酰化 还原 清洗 蛋白 验证 回收 释放 保证 | ||
【主权项】：
1.一种鉴定污染物分子蛋白靶点的方法，其步骤是：(1)将污染物的结构进行修饰，通过化学反应将污染物固定在琼脂糖微珠上形成复合物，不影响其毒性作用基团；(2)待测样品组织裂解液(320mM蔗糖、10mM Tris‑HCl、罗氏完全蛋白酶抑制剂，pH7.4)与复合物共同孵育，使与污染物相互作用的蛋白吸附到复合物上，离心分离复合物；(3)清洗复合物，去除与污染物非特异性结合的蛋白杂质；(4)通过复合物与5×SDS‑PAGE上样缓冲液共孵育，释放污染物结合蛋白；(5)通过SDS‑PAGE分离蛋白条带，切胶，然后用二硫苏糖醇进行胶内还原，再经碘乙酰胺酰化和胰蛋白酶切处理，回收多肽条段；(6)污染物结合蛋白的多肽条段通过鸟枪法蛋白质组质谱分析和物种蛋白数据库检索注释，鉴定结合蛋白的种类和丰度，与阴性对照比较和多种分子手段验证，确定污染物特异性结合的靶点蛋白。
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