[发明专利]一种Rho-ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法

摘要

本发明公开了一种Rho‑ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法，取出生后12天的小鼠卵巢，通过不同分离方法获得腔前卵泡，采用微滴的方式进行卵泡生长和卵母细胞体外成熟培养。实验设置空白对照组和含有Y27632的处理组。采用本发明的可以获得较为理想的体外培养系统。通过本研究表明，该抑制剂的确可以降低卵泡发育过程中颗粒细胞的凋亡，这为卵泡的继续发育提供了可靠保障。

主权项

1.一种Rho‑ROCK信号通路抑制剂Y27632对小鼠卵泡体外发育影响的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、小鼠腔前卵泡的分离：体视镜下获得小鼠卵巢，在超净工作台内，用分离液清洗3次后，机械分离法：将卵巢转移到含有2mL分离液的玻璃表面皿中，用解剖针在体视显微镜下钝性分离卵泡，保证单侧卵巢卵泡体外分离的时间不要超过30min；用培养液清洗三次后，检出形态完整、直径在100～130μm的卵泡；酶法：直接将卵巢放入消化液玻璃凹皿中，于37℃培养1h后，去掉消化液中的组织块，加入卵泡培养液低速离心5min中后弃上清，再用培养液清洗两次后，检出形态完整的腔前卵泡进行培养；酶法‑机械法：用消化液处理20min后，再采用上述机械法的分离方法；步骤2、腔前卵泡的培养：选用直径为60mm的培养皿，提前12h准备30μL升的卵泡培养液液滴，并在上面覆盖2mL矿物油；用自制玻璃口吸管将分离获得的腔前卵泡放入液滴中于37℃培养箱培养，每2d半量换液，并收集培养液上清；步骤3、卵泡RNA的提取、cDNA反转录及荧光定量PCR：收集5个培养前及培养后2d、4d、6d和8d的小鼠卵泡，在PBS中清洗3遍后，严格按照微量RNA提取试剂盒的说明书操作，用微量分光光度计检测符合标准的RNA样品按照反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒进行相关基因的检测；将结果输入Graphpad prism软件进行分析和制图；步骤4、卵泡活性检测：为评估并确定卵泡的存活率，按不同天数挑出的发育中的卵泡用荧光试剂Calcein AM和EthD‑1在黑暗条件下进染色中，在37℃培养箱中放置15min，然后在荧光显微镜下观察卵泡的活性；其中EthD‑1进入已发生细胞膜破损或凋亡的细胞中，发出明亮的红色荧光；根据颗粒细胞和卵母细胞都发出红光的比例判断卵泡的存活状态；步骤5、卵泡和卵母细胞的测量：换液后，在倒置显微镜下观察卵泡的发育情况并拍照，用ImageJ软件测量卵泡和卵母细胞的长轴和短轴直径，并且平均值作为卵泡和卵母细胞的直径，同时记录卵泡的存活情况；当观察到卵泡的卵母细胞和/或颗粒细胞颜色变暗，在显微镜下没有折光性时，则判断为卵泡已发生死亡；步骤6、统计学方法结果采用SPSS21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示；各组间采用单因素方差分析比较；P≤0.05为差异有统计学意义。