[发明专利]一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用

摘要

本发明公开了一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法及其应用，通过6条寡核苷酸链之间的DNA杂交反应分别构建两种Y型核酸限域体，进一步利用氯霉素核酸适配体与二者之间的杂交反应来抑制设计在两种Y型核酸限域体结构末端的类过氧化物DNA酶活性，由于氯霉素与其核酸适配体之间的特异性识别作用可引起上述DNA酶碱基序列的释放，进而结合氯化血红素形成DNA酶来实现其催化显色信号转导，以及显色产物吸光度与氯霉素分析物浓度之间的定量关系构建；本发明操作方便，成本低廉，选择性和灵敏度高，稳定性好，对于牛奶等复杂介质中氯霉素残留的快速检测具有很好应用价值。

主权项

1.一种检测氯霉素的均相比色生物分析方法，其特征在于包括以下步骤：（1）制备核酸限域体复合物依次将浓度为2μM的Y₁₁、Y₁₂和Y₁₃单链DNA各10μL与10μL的氯霉素适配体加入至PV管中，再置于95℃水浴中加热5min，自然冷却2h至室温，从而形成Y1‑aptamer核酸限域体结构；与此同时，依次将浓度为2μM Y₂₁、Y₂₂和Y₂₃单链DNA各10μL加入至另一PV管中，再置于95℃水浴中加热5min，自然冷却2h至室温，从而形成Y2核酸限域体结构；再将上述两个PV管中的溶液混合，在37℃条件下充分混匀反应1h，从而形成Y1‑aptamer‑Y2核酸限域体复合物；上述Y₁₁、Y₁₂、Y₁₃、Y₂₁、Y₂₂、Y₂₃单链DNA和氯霉素适配体的碱基系列为：Y₁₁: 5’‑GGA GCA GAC AAC GCC ACT CAT GTA GCA CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGG TTG GG‑3’；Y₁₂: 5’‑GTA GAT CAG AGT GTG CGT TGT CTG CTC CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGG TTG GG‑3’；Y₁₃: 5’‑GTG CTA CAT GAG TGA CAC TCT GAT CTA CCT ACC ACC GGG TAG GGC GGG TTG GG ‑3’；Y₂₁: 5’‑GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTT TCA TCG ACA GAT CCA GTC GCT GTC ATG‑3’；Y₂₂: 5’‑GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTC ATG ACA GCG ACT GTA CAG AAT CAT CTT‑3’；Y₂₃: 5’‑GGG TAG GGC GGG TTG GGA CAA CTC ACT GAA GTA AGA TGA TTC TGT AGA TCT GTC GAT GAA‑3’；氯霉素适配体：5’‑ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G ‑3’；（2）标准溶液中氯霉素含量的检测取6份体积均为70µL的核酸限域体复合物溶液分别置于6支PV管中，分别向其中加入10μL浓度梯度为20nM、50nM、100nM、200nM、500nM和1000nM的氯霉素标准溶液，将反应液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，接着向每支PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的Hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外‑可见分光光度计在390nm~480nm波长范围内记录检测标准溶液的吸收光谱，并根据420nm波长处的吸光度大小来进行工作曲线的构建和标准溶液中CAP的定量分析；（3）样品中氯霉素含量的检测将样品进行前处理后，取处理后的样品溶液10µL置于PV管中，向其中加入70µL核酸限域体复合物溶液，将混合液置于恒温混匀仪中在37℃下温育反应1h，再向PV管中加入90μL pH=7.4的HEPES缓冲溶液进行稀释，然后再向其中加入10μL浓度为3μM的hemin溶液，所述hemin溶液是由浓度为1mM的hemin原液经过pH=7.4的HEPES缓冲溶液稀释而成，将PV管置于25℃下继续混匀反应1 h；再向其中加入10μL浓度为10mM的H₂O₂溶液和10μL浓度为10mM的ABTS溶液，催化显色反应4min后，利用紫外‑可见分光光度计在390nm‑480nm波长范围内记录检测溶液的吸收光谱，并根据其420nm波长处的吸光度大小和工作曲线来计算样品溶液中的CAP含量。