[发明专利]一种高活性胆固醇氧化酶的生产方法在审
| 申请号： | 201910376869.9 | 申请日： | 2019-05-04 |
| 公开（公告）号： | CN110527672A | 公开（公告）日： | 2019-12-03 |
| 发明（设计）人： | 王友富;王荣;王炳乾;王洪福;邵振平;雷灵芝;黄橙橙;王瑞;陈克纲;应杨波 | 申请（专利权）人： | 浙江神洲药业有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/04 | 分类号： | C12N9/04;C12R1/13 |
| 代理公司： | 11525 北京红福盈知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 陈月福<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 317300 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种高活性胆固醇氧化酶的制备方法，具体包括以下步骤：S1、发酵上清液：取1环产胆固醇氧化酶短杆菌至种子摇瓶，在常温条件下培养10h，之后接至发酵摇瓶，在常温条件下培养38h，离心5min，取上清液100.00g；S2、盐析：在上述质量的发酵上清液中缓慢等量加入硫酸铵，并同时搅拌，使其混合饱和，室温静置4.5h后，用滤纸过滤，将滤液与沉淀物分离，并测定滤液中残留的酶活，并对沉淀物离心5min，用8％发酵液体积的缓冲液A溶解沉淀物，于透析袋中，并在去离子水中过夜；S3、装柱；S4、层析。 | ||
| 搜索关键词： | 胆固醇氧化酶 发酵上清液 常温条件 硫酸铵 溶解沉淀物 发酵液体 滤纸过滤 取上清液 室温静置 种子摇瓶 短杆菌 高活性 缓冲液 透析袋 层析 等量 酶活 水中 盐析 摇瓶 装柱 制备 发酵 离子 饱和 残留 | ||
【主权项】：
1.一种高活性胆固醇氧化酶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：/nS1、发酵上清液：取产胆固醇氧化酶短杆菌至种子摇瓶，产胆固醇氧化酶短杆菌由种子培养基和发酵培养基混合后常温发酵10h，所述种子培养基(g/dl)：牛肉膏0.3，蛋白胨1，NaCl 0.5，PH＝7.5；所述发酵培养基(g/dl)：胆固醇0.05，葡萄糖2，酵母膏0.75，NaCl0.1，CH3COONH4 0.2，K2HPO4 0.02，MgSO4·7H2O 0.005，FeSO4·7H2O 0.001，CaCl2 0.01，PH＝7.5，之后接至发酵摇瓶，在常温条件下静置38h，在常温以及转速6000r/min的低速离心机的调节下离心5min，取上清液100.00ml；/nS2、盐析：在上述质量的发酵上清液中缓慢等量加入硫酸铵，并同时搅拌，使其混合饱和，室温静置4.5h后，用滤纸过滤，将滤液与沉淀物分离，并对沉淀物离心5min，用8％体积的缓冲液A溶解沉淀物于透析袋中，并在去离子水中过夜得混合液，所述缓冲液A为5mmol/l磷酸钾缓冲液，所述缓冲液A的PH＝7.5；/nS3、装柱：取10g干凝胶SephadexLH20浸入100ml饱和胆固醇乙醇溶液，静置过夜，使其充分溶胀形成湿凝胶，将形成的湿凝胶装于2.6×10cm层析柱内，用S2中混合液洗柱，使胆固醇完全结晶，并得到混合样品；/nS4、层析：取一个玻璃容器，往玻璃容器中加入1-5ml的S3中的混合样品，再用相对于混合样品1-5倍体积的缓冲液A洗去杂物，清洗流速为0.5-2ml/min；接着再用缓冲液B洗脱，其中所述缓冲液B为10mmol/l磷酸钾缓冲液，所述缓冲液B的PH＝7.2，并且含0.1 ％表面活性剂TritonX-100，清洗流速为0.5-2ml/min；最终获得高活性胆固醇氧化酶。/n
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