[发明专利]用于1BL/1RS 易位系小麦1BL/1RS染色体改良的分子标记检测体系及其应用

摘要

本发明公开了一种用于1BL/1RS易位系小麦1BL/1RS染色体改良的分子标记检测体系及其应用。本发明给出了用于1BL/1RS易位系小麦染色体改良的分子标记检测体系，基于此体系能够利用分子育种技术高效创制具有黑麦1RS的丰产抗逆性，同时对小麦加工品质无显著影响的新型1BL/1RS染色体，从而改良1BL/1RS易位系小麦加工品质，为小麦品质育种提供新的种质资源。

主权项

1.用于1BL/1RS 易位系小麦1BL/1RS染色体改良的分子标记检测体系，采用分子标记对染色体的特定位点进行特异性检测，以实现对1BL/1RS 易位系小麦1BL/1RS染色体的高效改良，其特征在于：A、1RS染色体臂的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：1，5'‑ GGAGACATCATGAAACATTTG‑3'， SEQ ID NO：2，5'‑CTGTTGTTGGGCAGAAAG‑3'；PCR反应体系20 μL： 2×Taq PCR StarMix GenStar10 μL，引物10 μmol/L各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng ，ddH₂O 8 μL；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min；PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录；扩增片段长度1500 bp，PCR扩增条带单一清晰，特异性高，能够有效鉴定1RS染色体臂；B、1BS 染色体臂的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：3，5'‑ G GTACCAACAACAACAACCC‑3', SEQ ID NO：4，5'‑GTTGCTGCTGAGGTTGGTTC ‑3'；PCR反应体系 20 μL： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng ，ddH₂O 8 μL；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性1min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸5 min；PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录；扩增片段长度636 bp，PCR扩增条带单一清晰，特异性高；能够有效鉴定1BS染色体臂；C、1RS染色体臂和1BS染色体臂的多重PCR检测：PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，1RS和1BS染色体臂检测引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL50‑100 ng，ddH₂O 7 μL；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸10 min；PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录；有效分辨1RS染色体臂纯合体、1BS染色体臂纯合体和二者的杂合体；D、小麦优质亚基By8的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：5， 5'‑ TTAGCGCTAAGTGCCGTCT‑3'， SEQ ID NO：6，5'‑TTGTCCTATTTGCTGCCCTT‑3'；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，64 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min；PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录；含有亚基By8基因的材料扩增出527 bp片段，在含有亚基By8基因的材料中特异扩增出单一条带；E、小麦优质亚基By9的分子检测：引物序列： SEQ ID NO：7，5'‑ TTCTCTGCATCAGTCAGGA‑3'，SEQ ID NO：8，5'‑AGAGAAGCTGTGTAATGCC ‑3'；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，59 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录；标记在含有亚基By9基因的材料中特异扩增出662 bp片段；F、小麦优质亚基By16的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：9，5'‑ GCAGTACCCAGCTTCTCAA‑3'， SEQ ID NO：10，5'‑CCTTGTCTTGTTTGTTGCC ‑3'；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，62 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录 ；标记仅在含有亚基By16基因的材料中特异扩增出3条带；G、小麦优质亚基Bx14的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：11，5'‑TAAGCGCCTGGTCCTCTTTGCG‑3'， SEQ ID NO：12，5'‑CTTGTTGTGCTTGTCCT GAT‑3'；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，63 ℃退火45 sec，72 ℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸10 min ；PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录 ；标记仅在含有亚基Bx14基因的材料中特异扩增出单一清晰条带，长度为1256 bp；H、小麦优质亚基Bx17的分子检测：引物序列： SEQ ID NO：13，5'‑ CGCAACAGCCAGGACAATT‑3'，SEQ ID NO：14，5'‑AGAGTTCTATCACTGCCTGGT‑3 '；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng ，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，59 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录 ；标记Bx17在含有亚基Bx17基因的材料中特异扩增出675 bp单一条带，而在含有其他亚基基因的材料中扩增出2条带，长度分别为650 bp和 750 bp ；I、基于标记PSR128的Ph1基因的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：15，5'‑ ATCGCTCCTCTGCTTGCTTC‑3'， SEQ ID NO：16，5'‑ GACCGCCTGAAACCTCCC‑3 '；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性30 sec，64 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录；标记在ph1b突变体中无扩增条带，而在非ph1b突变体中特异扩增出260 bp单一条带，标记PSR128扩增条带特异、清晰、单一；J、基于标记PSR574的Ph1基因的分子检测：引物序列： SEQ ID NO：17，5'‑ AGCGTATATTCACGCGCTCC‑3'， SEQ ID NO：18，5'‑GTAAGAACTCCCCAGGGTTT G‑3 '；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性30 sec，62 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录 ；标记PSR574在ph1b突变体中无扩增条带，而在非ph1b突变体中特异扩增出154 bp或308 bp单一条带；扩增条带特异、清晰、单一；K、基于标记Glu‑B3i的携带Glu‑3/Gli‑1位点的1BS染色体臂小片段的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：19，5'‑ TATAGCTAGTGCAACCTACCAT‑3'， SEQ ID NO：20，5'‑ TGGTTGTTGCGGTATAATTT‑3 '；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，58 ℃退火45 sec，72 ℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录 ；标记Glu‑B3i仅在Glu‑B3i基因型材料中特异扩增出621 bp单一条带；L、基于标记Glu‑B3bef的携带Glu‑3/Gli‑1位点的1BS染色体臂小片段的分子检测：引物序列： SEQ ID NO：21，5'‑ GCATCAACAACAAATAGTACTAGAA‑3'，SEQ ID NO：22， 5'‑GGCGGGTCACACATGAC A‑3 '；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，60 ℃退火45 sec，72 ℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录 ；标记Glu‑B3bef在Glu‑B3b、Glu‑B3e和Glu‑B3f基因型材料中扩增出750 bp单一条带；M、基于标记Glu‑B3d的携带Glu‑3/Gli‑1位点的1BS染色体臂小片段的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：23， 5'‑ CACCATGAAGACCTTCCTCA‑3'，SEQ ID NO：24，5'‑GTTGTTGCAGTAGAACTGGA‑3 '；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，58 ℃退火45 sec，72 ℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录 ；标记Glu‑B3d仅在Glu‑B3d基因型材料中特异扩增出662 bp单一条带；N、基于标记Glu‑B3h的携带Glu‑3/Gli‑1位点的1BS染色体臂小片段的分子检测：引物序列：SEQ ID NO：25， 5'‑ CCACCACAACAAACATTAA‑3'，SEQ ID NO：26， 5'‑GTGGTGGTTCTATACAACGA‑3 '；PCR反应体系 20 μL ： 2×Taq PCR StarMix GenStar 10 μL，引物 10 μmol/L 各1 μL，模板基因组DNA 1 μL 50‑100 ng，ddH₂O 8 μL ；PCR 扩增程序：94ºC 预变性5 min；94 ℃变性45 sec，60 ℃退火45 sec，72 ℃延伸90 sec，30个循环；72℃延伸5 min ；PCR扩增产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲液为 1×TAE，溴化乙锭染色观察记录；标记Glu‑B3h仅在Glu‑B3h基因型材料中特异扩增出1022 bp单一条带。