[发明专利]一种真菌基因敲除双荧光筛选方法有效
申请号: | 201910417135.0 | 申请日: | 2019-05-20 |
公开(公告)号: | CN110117609B | 公开(公告)日: | 2023-06-02 |
发明(设计)人: | 陶芳;赵凯;项芳芝;赵倩倩 | 申请(专利权)人: | 安徽农业大学 |
主分类号: | C12N15/80 | 分类号: | C12N15/80;C12N15/90;C12N15/65;C12R1/67 |
代理公司: | 安徽汇朴律师事务所 34116 | 代理人: | 汪蕙 |
地址: | 230031 *** | 国省代码: | 安徽;34 |
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摘要: | 本发明公开了一种真菌基因敲除双荧光筛选方法,涉及真菌基因敲除技术领域,该方法包括扩增pYES2载体DNA模板中的2.9‑kb URA3‑2micro2_origin片段并将该片段插入pCAMBIA1300载体,获得pUM载体;然后分别扩增tef1启动子、eGFP基因、PgpdA启动子、ble抗性基因、RFP基因、TtrpC终止子、目标基因x的上游同源臂、目标基因x的下游同源臂;最终构建目标基因x的敲除载体pKO‑x;将pKO‑x转化入农杆菌感受态细胞,通过农杆菌介导方法转化真菌,先进行抗生素筛选,获得抗性转化子,将抗性转化子再进行荧光显微镜检测,若只发红色荧光,则为目标转化子,既有绿色荧光也有红色荧光者为异位整合的转化子,无荧光者为野生型;本发明提供的方法能够有效将目标转化子与异位整合的转化子区分开来。 | ||
搜索关键词: | 一种 真菌 基因 荧光 筛选 方法 | ||
【主权项】:
1.一种真菌基因敲除双荧光筛选方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:步骤1、扩增pYES2载体DNA模板中的2.9‑kb URA3‑2micro2_origin片段;步骤2、将步骤1扩增获得的片段插入pCAMBIA1300载体的Sac II位点,获得pUM载体;步骤3、以黄曲霉菌基因组DNA为模板扩增tef1启动子、以eGFP基因为模板扩增eGFP基因、以pAN7‑1载体为模板扩增PgpdA启动子、以pAF载体为模板扩增ble抗性基因、以RFP基因为模板扩增RFP基因、以pAN7‑1载体为模板扩增TtrpC终止子、目标基因x的上游同源臂、目标基因x的下游同源臂;步骤4、将步骤2获取的pUM载体和步骤3获取的所有扩增片段一起转入酵母菌感受态细胞,在SC‑U培养基上进行筛选培养,获得阳性转化子,提取转化子中的质粒,即为目标基因x的敲除载体pKO‑x;步骤5、鉴定将步骤4获取的目标基因x的敲除载体pKO‑x转化入农杆菌感受态细胞,通过农杆菌介导方法转化真菌,先进行抗生素筛选,获得抗性转化子,将获得的抗性转化子再进行荧光显微镜检测,若只发红色荧光,则为目标转化子,既有绿色荧光也有红色荧光者为异位整合的转化子,无荧光者为野生型。
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