[发明专利]一种适用于Iso-Seq的百合鳞茎总RNA提取方法

摘要

本发明涉及分子生物学领域，旨在提供一种适用于Iso‑Seq的百合鳞茎总RNA提取方法，包括：将块状组培鳞茎研磨呈粉末，加入裂解液CLB和β‑巯基乙醇混合液中，裂解至匀浆状态；通过增加样品量和裂解液体积以从总量上提高RNA浓度，并通过加入β‑巯基乙醇结合裂解液以及一系列操作优化裂解过程，有效去除多糖和酚类，使RNA更好地从组织中溶出，再用三倍的基因组清除柱分别去除DNA，最后通过一个吸附柱浓缩RNA，进一步提高RNA浓度。本发明不需使用酚、氯仿等有毒的刺激性试剂，更好保护了操作人员的安全；操作简单，耗时短；提取的RNA完整性好，纯度高，可满足于全长转录组测序等绝大多数分子生物学实验的需要。

主权项

1.一种适用于Iso‑Seq的百合鳞茎总RNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对实验过程中所用物品及器材进行消毒和灭菌；(2)取块状组培鳞茎的样品，在以液氮维持温度的条件下进行研磨；所得粉末状样品倒入离心管，置于液氮中备用；(3)向新的离心管中依次加入裂解液CLB和β‑巯基乙醇；混匀后加入备用的粉末状样品，裂解至匀浆状态；(4)对裂解物离心处理，取上清加入新的离心管，加入一半体积的无水乙醇；吹打混匀后，立即将混合物加入基因组清除柱；对清除柱离心，弃废液；(5)将基因组清除柱放入新的离心管内，加裂解液RLT PLus后离心处理；收集滤液，并记下体积，加入一半体积的无水乙醇，立即吹打混匀；(6)将混合物加入吸附柱RA中，对吸附柱RA离心，弃废液；(7)向吸附柱RA中加入去蛋白液RW1，室温放置后离心，弃废液；以漂洗液RW对吸附柱RA漂洗两次后，再进行处理后的离心；(8)将吸附柱RA放入RNase free离心管中，加入RNase free water洗脱，得到总RNA溶液。