[发明专利]一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法

摘要

本发明公开了一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，包括三个步骤，即首先对罗布麻进行选种，然后通过EMS诱变预试验选择合适的EMS浓度，最后根据实验结果对罗布麻EMS诱变突变体库构建。本发明采用化学诱变剂EMS对罗布麻进行诱变，其EMS诱变剂浓度和诱变时间、方式得到确定，通过该方法可高效的获得罗布麻突变体库，并进行了筛选，获得叶色叶型、株型变异以及高黄酮含量的突变体植株材料，为种质创新、基因功能验证等奠定了良好的基础。

主权项

1.一种通过EMS诱变罗布麻产生突变体库的方法，其特征在于，包括三个步骤，即首先对罗布麻进行选种，然后通过EMS诱变预试验选择合适的EMS浓度，最后根据实验结果对罗布麻EMS诱变突变体库构建；选种选择经过脱粒后清除杂质且剔除不饱满的罗布麻种子；EMS诱变预试验步骤为：步骤一：取12个50 mL离心管，然后在每个离心管中加入30 mL ddH₂O；然后称取罗布麻种子1.5 g加入ddH₂O中，保持质量体积比为1:20；在28℃条件下220 r/min ，45°夹角摇动处理24 h，让种子充分吸胀，12 h时换一次ddH₂O；步骤二：再用水配制含有0.5%、0.7%和0.9%的EMS溶液，EMS诱变预试验步骤一的离心管24 h后倒出ddH₂O，然后加入30 mL三种不同浓度的EMS溶液至罗布麻种子离心管中，每个浓度处理3管，余下的3管用30 mL ddH₂O做为对照，按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行摇动13 h；步骤三：处理完成后，离心管中倒掉EMS溶液，用ddH2O充分冲洗处理过的种子，冲洗10次；步骤四：冲洗完成后，将种子倒在滤纸上，过夜晾干；步骤五：在培养皿中铺上滤纸，并湿透水，每个培养皿中点70粒EMS诱变预试验步骤四处理过的种子做萌发实验；步骤六：定期统计不同EMS浓度处理种子的萌发率和最终的成苗率，选择成苗率接近50%的EMS浓度进行批量处理，前7天统计萌发率，以露白为标准，第10天时统计成苗率；罗布麻EMS诱变突变体库构建步骤如下：步骤一：根据EMS诱变预试验的结果，选用0.7%的EMS进行批量处理罗布麻种子，种子预先按照EMS诱变预试验步骤一的方法进行吸胀处理，然后按照EMS诱变预试验步骤二的方法进行诱变处理，为了达到构建10000个突变体的规模，处理种子约20000粒；步骤二：种子处理完晾干后（此时处理完的种子属于M1代），按粒点播在育种苗盘中，进行常规管理；步骤三：罗布麻种子苗当年不能开花结实，由种子长成的植株2‑3年才能收种，为了鉴定EMS诱变的效果，在M1代幼苗中调查显性突变性状，对性状明显发生改变的植株单独编号，幼苗长大后移栽到大田中，正常田间管理，保存突变体，其它播种的突变体材料也同时移栽管理；步骤四：育苗盘中突变体植株长到6周时，取长势基本一致的突变体和对照材料相同叶位的叶子进行总黄酮含量的检测；步骤五：F3H是罗布麻黄酮生物合成途径中的一个关键合成酶基因，为了检测EMS在分子层面的诱变效果，取突变体和对照植株的叶片提取DNA，然后扩增F3H基因，最后对基因进行测序。