[发明专利]区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒

摘要

区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒，属于病毒检测领域。本发明以NP蛋白为免疫抗原，以单克隆抗体为抗体诊断试剂，利用棋盘法对包被抗原及单抗浓度进行优化，对包被时间、一抗浓度及孵育时间、二抗浓度及孵育时间等条件优化；根据工作浓度将免疫抗原包被于ELISA孔中，同时以不同稀释倍数的样本血清与固定稀释倍数的单克隆抗体混合后进行阻断实验，将混合物与固相抗原结合作用，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG为二抗继续孵育，用TMB显色液显色，加入2M硫酸溶液终止反应。本发明可有效移除传染源，消灭持久疫源地的存在，为新城疫的净化提供理论依据，具有检测灵敏、准确，操作简便及特异性强的优点。

主权项

1.区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备免疫抗原(1)将NP蛋白基因克隆至T载体中，构建重组克隆质粒T+NP，并测序鉴定；(2)对重组克隆质粒T+NP和pET28a(+)载体进行双酶切，将回收的目的基因及载体基因进行连接构建重组表达质粒pET28a+NP；(3)对重组表达质粒pET28a+NP进行诱导表达，经纯化后获得NP蛋白，作为免疫抗原；步骤二、制备单克隆抗体(1)将纯化的NP蛋白免疫BALB/c小鼠，再将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合筛选，制备杂交瘤细胞株；(2)将杂交瘤细胞株腹腔注射BALB/c小鼠，取腹水加以纯化，即为单克隆抗体，作为抗体诊断试剂；步骤三、间接竞争ELISA方法条件优化抗原包被浓度为0.781μg/mL，单克隆抗体稀释倍数为1:800，单克隆抗体孵育时间为90min，酶标二抗稀释倍数为1:5000，酶标二抗孵育时间为60min，样品血清稀释倍数为1:20；步骤四、确定间接竞争ELISA方法的判定标准当待检血清抑制率I％≥35％时，判定为阳性即野毒感染；当待检血清抑制率I％<35％时，判定为阴性即新城疫病毒样颗粒疫苗免疫；步骤五、待检血清检测根据步骤三确定的优化条件，将免疫抗原包被于ELISA孔中，将稀释后的样品血清与单克隆抗体混合后进行阻断实验，再与固相抗原结合作用，加入酶标二抗继续孵育，最后用TMB显色液显色，加入2M硫酸溶液终止反应并读数。