[发明专利]高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法及菌株

摘要

本发明涉及本发明涉及一种高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，以及筛选到的诱变株，由诱变株获得的重组工程菌及应用。本发明筛选获得的一株高产两性霉素B结节链霉菌菌株——结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050。本发明的有益效果主要体现在：1、通过高通量筛选高产两性霉素B菌种的方法，能够方便快速高效地检测两性霉素B的产量，提高了诱变育种和基因工程菌株的筛选或验证效率。2、诱变育种获得的结节链霉菌N5，相对原始菌株N3，两性霉素B产量提高了20％，能够作为基因工程菌的原始菌株。3、通过过表达功能基因分别提高两性霉素B的产量，其中乙酰辅酶A羧化酶1(acc1)提高两性霉素B产量20％。4、卡那霉素价格优廉、抗菌谱广、杀菌作用强，适用于工业中使用，对于企业总体收益率有较强提高作用，以实验室5L罐为计算，能降低成本约2000元/罐。

主权项

1.高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，所述方法包括：/n(1)将结节链霉菌接种至GYM平板25～26℃培养5～7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子离心后去上清液，加入无菌水重悬后，离心、重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液；/n(2)取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，25～26℃避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用NTG处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用50mM含5mg/mL NTG的PBS缓冲液处理0.5h，离心，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在GYM固体培养基中，26℃避光培养直至获得突变株；/n(3)突变株涂布于GMY固体培养基上，26℃培养4～7天至能观测到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基，按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；/n(4)将酵母菌X33作为敏感菌株，接种于GYM液体培养基，28℃，200rpm培养24小时，涂布于GYM固体培养基；将结节链霉菌单菌落利用无菌打孔器或无菌200μL的枪头，打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布酵母X33的固体培养基，26℃培养20小时后，观测抑菌圈大小，筛选获得高产两性霉素B结节链霉菌。/n