[发明专利]基于磁性荧光探针的食品大肠杆菌菌落可视化检测及自动化计数方法

摘要

本发明属于微生物检测技术领域，涉及一种基于磁性荧光探针的食品大肠杆菌菌落可视化检测及自动化计数方法；具体步骤为：首先制备获得磁性荧光探针，然后培养食品中菌株菌落；再将磁性荧光探针加入到食品菌株菌落平板中，放入便携式荧光成像仪中，获取菌落荧光平板图像；菌落中有大肠杆菌时，特异性荧光碳量子点会吸附在大肠杆菌菌落上，使大肠杆菌的菌落显示荧光；否则不显示荧光；由此，实现了大肠杆菌菌落可视化识别；然后，对获取的大肠杆菌菌落荧光平板图像输入计算机程序进行处理，实现大肠杆菌的自动计数；本发明利用特异性的荧光探针定位大肠杆菌菌落，实现了大肠杆菌菌落荧光可视化检测，并且能够实时、准确计算大肠杆菌的含量。

主权项

1.基于磁性荧光探针的食品大肠杆菌菌落可视化检测及自动化计数方法，其特征在于，步骤如下：步骤1、磁性纳米微球的制备，记为Fe₃O₄@SiO₂‑cDNA；步骤2、荧光碳量子点的制备，记为aptamer‑CQDs；步骤3、磁性荧光探针Fe₃O₄@SiO₂‑CQDs的制备，将步骤1中得到的Fe₃O₄@SiO₂‑cDNA和步骤2中得到的aptamer‑CQDs常温下混合孵育，磁性分离除去多余的Fe₃O₄@SiO₂‑cDNA，获得磁性荧光探针Fe₃O₄@SiO₂‑CQDs；步骤4、食品中菌株菌落的培养；对食品样品稀释后，制备十倍递增系列稀释样品匀液，稀释梯度分别为10^‑(p+1)，10^‑(p+2)，10^‑(p+3)，……，10^‑(p+i)，其中p为大于或等于零的整数，i为大于零的整数；然后对不同梯度的样品稀释匀液进行涂布平板培养，每个梯度接种n个固体培养基平板，n为大于零的整数；每个平板加入菌液进行涂布，然后将平板倒置于一定环境中进行培养，培养后得到了不同稀释梯度的食品菌株菌落平板；步骤5、大肠杆菌菌落的快速识别；将步骤3中制备的磁性荧光探针Fe₃O₄@SiO₂‑CQDs加入到步骤4中的不同稀释梯度的食品菌株菌落平板中，静置一段时间；若菌落为大肠杆菌时，则大肠杆菌会与aptamer‑CQDs结合，导致Fe₃O₄@SiO₂‑cDNA和aptamer‑CQDs分离；若菌落不是大肠杆菌，Fe₃O₄@SiO₂‑cDNA和aptamer‑CQDs不会分离，以Fe₃O₄@SiO₂‑CQDs的形式存在；用磁铁吸附将菌落平板中的Fe₃O₄@SiO₂‑cDNA和Fe₃O₄@SiO₂‑CQDs与菌落分离，然后将生长有菌落的平板皿底放入便携式荧光成像仪中，获取稀释梯度为10^‑(p+1)的n个菌落平板的荧光平板图像，记为P_1‑1、P_1‑2、P_1‑3、……、P_1‑n，n为大于零的整数；同理获取n个稀释梯度为10^‑(p+2)的荧光平板图像P_2‑1、P_2‑2、P_2‑3、……、P_2‑n，获取菌液稀释梯度为10^‑(p+3)的荧光平板图像P_3‑1、P_3‑2、P_3‑3、……、P_3‑n，……，获取稀释梯度为10^‑(p+i)的荧光平板图像P_i‑1、P_i‑2、P_i‑3、……、P_i‑n，总共得到了i×n个菌落荧光平板图像，i和n为大于零的整数；如果菌落中有大肠杆菌，aptamer‑CQDs会吸附在大肠杆菌菌落上，则大肠杆菌的菌落显示荧光；如果菌落中没有大肠杆菌aptamer‑CQDs不会吸附在非大肠杆菌菌落上，同时非大肠杆菌菌落不显示荧光；由此，实现了大肠杆菌菌落的快速和可视化识别；步骤6、食品中大肠杆菌菌落的自动计数；(1)对步骤5获取的i×n个菌落荧光平板图像进行预处理，利用彩色图像滤波函数imfilter对菌落荧光平板图像进行线性滤波，去除图像中的噪声；(2)阈值分割：提取预处理图像的蓝(B)通道分量图像，并将分量图像灰度化，获得B分量图像的阈值T；利用阈值T对大肠杆菌菌落进行分割，将高于阈值T的像素点定为1，低于阈值T的像素点定为0，得到了荧光平板菌落分割图像；(3)荧光平板菌落计数：采用八邻域边缘跟踪法检测荧光平板菌落分割图像的菌落边缘，并利用连通区域计数法对大肠杆菌菌落计数；对得到的i×n个荧光平板菌落分割图像菌落计数，计算每个稀释梯度的大肠杆菌平均菌落数，稀释梯度为10^‑(p+1)的大肠杆菌平均菌落数记为N₁，稀释梯度为10^‑(p+2)的大肠杆菌平均菌落数记为N₂，稀释梯度为10^‑(p+3)的大肠杆菌平均菌落数为N₃，……，稀释梯度为10^‑(p+i)的大肠杆菌平均菌落数为N_i，其中，p为大于或等于零的整数，i和n为大于零的整数，并根据计算公式自动计算出食品中大肠杆菌菌落总数；所述计算公式具体分为4种：A、若只有一个稀释梯度(10^‑(p+k))平板的大肠杆菌菌落数在20～200CFU之间，则计数该稀释梯度菌落平板上的大肠杆菌菌落数，样品中菌落数的计算公式为C(CFU/mL)＝N_k/(V×10^‑(p+k))；其中，C为食品样品中的大肠杆菌菌落数，N_k为大肠杆菌菌落数，10^‑(p+k)为稀释梯度值，k为小于i的整数，i为大于零的整数，V为涂布平板时加入的食品样品菌液体积，单位为mL；B、若所有稀释梯度菌落平板的大肠杆菌菌落数都小于20CFU，即N₁，N₂，N₃，……，N_i＜20CFU，则计数最低稀释梯度菌落平板上的大肠杆菌菌落数，样品中菌落数的计算公式为C(CFU/mL)＝N₁/(V×10^‑(p+1))；其中，C为样品中的大肠杆菌菌落数，N₁为最低稀释梯度的大肠杆菌菌落数，10^‑(p+1)为最低稀释梯度值，V为涂布平板时加入的食品样品菌液体积，单位为mL；C、若某一稀释梯度(10^‑(p+k))菌落平板的菌落数大于200CFU，但是下一梯度平板上没有大肠杆菌菌落，或者虽有大肠杆菌菌落但菌落数不在20～200CFU范围内，应计数该稀释梯度培养皿上的大肠杆菌菌落，食品样品中菌落数的计算公式为C(CFU/mL)＝N_k/(V×10^‑(p+k))；其中，C为食品样品中的大肠杆菌菌落数，N_k为大肠杆菌菌落数，10^‑(p+k)为稀释梯度值，k为大于或等于零小于i的整数，V为涂布平板时加入的样品菌液体积，单位为mL；D、若有2个连续梯度(10^‑(p+k)和10^‑(p+k+1))菌落平板的菌落数均在20～200CFU之间，食品样品中的菌落数的计算公式为C(CFU/mL)＝(N_k+N_k+1)/(1.1V×10^‑(p+k))；其中，C为食品样品中的大肠杆菌菌落数，N_k为低稀释梯度大肠杆菌菌落数，N_k+1为高稀释梯度大肠杆菌菌落数，1.1为计算系数，10^‑(p+k)为低稀释梯度的稀释梯度值，k为大于或等于零小于i的整数，V为涂布平板时加入的食品样品菌液体积，单位为mL。