[发明专利]一种多黏菌素耐药基因的检测方法

摘要

本发明公开了一种多黏菌素耐药基因的检测方法，首先准备材料，包括菌株与质粒、试剂、仪器，引物设计，DNA模板制备，采用多重PCR反应体系及程序进行PCR产物测序。本发明的有益效果是节省检测时间，减少工作、节省费用，且操作简便，适合临场和研究检测用。

主权项

1.一种多黏菌素耐药基因的检测方法，其特征在于包括以下步骤：(一)材料：(1)菌株与质粒基因重组构建pBAD质粒上的mcr‑6、mcr‑7、mcr‑8大肠杆菌，选取临床菌株以及检测所用菌株；(2)试剂MHA培养基；DNA分子标准量Marker购博迈德生物技术有限公司；2×Taq Master Mix诺唯赞生物技术有限公司；TAE缓冲液本实验室提供配置；琼脂糖、GelRed染料购自上海拜力生物科技有限公司；(3)仪器：摇床、37℃恒温培养箱、凝胶电泳仪、凝胶成像仪、PCR仪；(二)引物设计采用primer premier 5.0人工设计，采用每条引物与非目的基因同源性最低，与目的基因同源性最高，做到最高的特异性，引物由博迈德生物科技有限公司合成；(三)DNA模板制备将携带mcr‑6、mcr‑7、mcr‑8菌株复苏，纯化，挑取单菌落，接种于2mL含100μg/mL的MHB液体培养基中，在37℃的条件下，200rpm，过夜培养，离心收菌，水煮法提取DNA；(四)多重PCR反应体系及程序1、PCR反应体系：2μL水煮或试剂盒提取的DNA为模板，引物1μL，2×TaqDNA聚合酶12.5μL，用蒸馏水补足25μL；2、PCR反应条件：预变性94℃，时间3min；变性94℃，时间30s；退火56℃，时间30s；延伸72℃，时间1min；最后延伸3min；(五)PCR产物测序PCR产物凝胶电泳检测：配制1.2％凝胶块，120V电压，电泳时间20分钟，凝胶成像。