[发明专利]一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法

摘要

本发明公开了一种改良的小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞分离的方法，利用本发明提供的方法，可快速从小鼠肝脏中分离出大量具有高活力的门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞，所得细胞能保持良好的原代肝细胞形态特征和肝细胞的功能，为门静脉周、中央静脉周肝细胞的分离与鉴定，体外研究门静脉周、中央静脉周肝细胞代谢差异以及更深层次探索肝细胞异质性的研究提供基础。

主权项

1.一种小鼠门静脉周肝细胞和中央静脉周肝细胞的分离方法，包括下述步骤：（1）小鼠门静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30‑40 rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏门静脉插入；2)门静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断下腔静脉，并把离体灌注机的速度调至50‑60rpm/min，用36‑38℃冲洗液从门静脉进行灌注，持续灌注直到下腔静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式，速度为10‑15rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从下腔静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为40‑50rpm/min；4)继续灌注20‑30mL的冲洗液后，开始灌注36‑38℃消化液，速度为40‑45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；（2）小鼠中央静脉周肝细胞的分离1)离体灌注机的速度调至30‑40rpm/min，将一次性静脉采血针一端和离体灌注机相连，另一端从小鼠肝脏下腔静脉插入；2)中央静脉周肝细胞分离灌注：打开机器，立即剪断门静脉，将离体灌注机的速度调至50‑60rpm/min，用36‑38℃的冲洗液从下腔静脉进行灌注，持续灌注直到门静脉处流出的液体颜色澄清；3)离体灌注机设置为逆流模式，速度为10‑15rpm/min，然后使用注射器将损伤剂从门静脉处注射进去，直到肝脏表面出现均匀白色小点，立即将离体灌注机设置为正流模式，速度为40‑50rpm/min；4)继续灌注20‑30mL的冲洗液后，开始灌注37℃的消化液，速度为40‑45rpm/min，直到肝脏膨大并在出现膨大现象后3min之内塌陷下去，此为消化完成；所述消化液配方：使用DMEM将10*HBSS稀释成含有1*HBSS的溶液，加入Ⅳ胶原酶溶液使胶原酶的终浓度为0.5‑0.6mg/mL；所述冲洗液配方：PBS中加入EGTA，使其终浓度为5‑5.5mM；所述损伤剂配方：洋地黄皂苷溶解于灭菌超纯水中，使其终浓度为5‑5.5mM；（3）小鼠门静脉周肝细胞和小鼠中央静脉周肝细胞单细胞悬液的获得将步骤（1）和（2）消化后的细胞悬液分别过60‑70μm细胞筛，得小鼠门静脉周肝细胞和小鼠中央静脉周肝细胞的单细胞悬液，分别离心后重悬，即得。