[发明专利]中华鳖类固醇生成因子-1多克隆抗体的制备方法及应用

摘要

本发明实施例公开了一种中华鳖中华鳖类固醇生成因子‑1多克隆抗体的制备方法及应用，所述中华鳖中华鳖类固醇生成因子‑1多克隆抗体的制备方法包括(1)中华鳖Sf‑1基因的克隆；(2)中华鳖Sf‑1基因重组表达载体的构建；(3)中华鳖Sf‑1重组蛋白的诱导表达和纯化及Western Blot进行特异性分析；(4)多克隆抗体的制备。本发明采用分子生物学和基因工程的方法，构建了中华鳖Sf‑1基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。本发明的方法制备的中华鳖Sf‑1多克隆抗体可用于免疫组化、免疫印迹实验要求，建立体外免疫分析、研究中华鳖Sf‑1的功能以及中华鳖免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于龟鳖类、爬行类、鸡的类固醇生成因子‑1的免疫检测。

主权项

1.一种中华鳖类固醇生成因子‑1多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、中华鳖Sf‑1基因的克隆：提取中华鳖总RNA，用M‑MLV反转录酶合成cDNA第一链，于温度为‑80℃保存；根据GenBank数据库中的Sf‑1基因序列，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，获得中华鳖Sf‑1基因cDNA片段；进行5′RACE‑PCR和3′RACE‑PCR扩增，获得中华鳖Sf‑1基因cDNA片段的5′末端和3′末端，拼接获得中华鳖Sf‑1基因全长cNDA序列；中华鳖Sf‑1基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；步骤二、中华鳖Sf‑1基因重组表达载体的构建：构建中华鳖Sf‑1基因全长cDNA序列，设计第二对特异性引物Sf‑1‑F1和Sf‑1‑R1，分别在上、下游引物添加BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点；以中华鳖cNDA为模板，Sf‑1‑F1和Sf‑1‑R1为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET‑32a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET‑Sf‑1；步骤三、中华鳖Sf‑1重组蛋白的诱导表达和纯化及Western Blot进行特异性分析：将步骤二得到的重组表达载体pET‑Sf‑1转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有100mg/mL氨苄抗性的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；经离心收集菌体、PBS重悬和超声波破碎后，加入5×上样缓冲液进行12％SDS‑PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有100mg/mL氨苄抗性的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体用变性结合缓冲液溶解，超声波破碎，再离心收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的中华鳖Sf‑1重组蛋白；SDS‑PAGE电泳检测纯化的中华鳖Sf‑1重组蛋白；步骤四、多克隆抗体的制备：将步骤三纯化的pET‑Sf‑1重组蛋白作为抗原，对小鼠进行免疫，按体积比1:1的比例加入弗氏完全佐剂，采用腹部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，收集鼠抗血清，纯化得到中华鳖Sf‑1多克隆抗体。