[发明专利]一种检测绵羊SPATA6基因单核苷酸多态性的方法及应用

摘要

本发明公开了一种检测绵羊SPATA6基因单核苷多态性的方法，包括以下步骤：S1样品选取、S2 cDNA池的构建、S3 PCR扩增、S4产物测序与单核苷酸多态性分型、S5绵羊SPATA6基因单核苷酸多态性位点的频率统计及其与睾丸表型的关联分析；本发明还提供一种检测绵羊SPATA6基因单核苷多态性的应用：通过因和基因型频率计算、荧光多重酶连接反应技术的分型结果、睾丸表型数据、SAS（9.2）软件分析数据，进而充分构建睾丸表型与精子发生相关基因6的第72272位TC突变的单核苷酸多态性的关系，选育高繁殖力的绵羊提供筛选标记。

主权项

1.一种检测绵羊SPATA6基因单核苷多态性的方法，其特征在于：包括以下步骤：S1样品选取：采集299只饲养条件相同的6月龄湖羊屠宰后的睾丸、附睾，并测定睾丸、附睾的重量和体积；S2 cDNA池的构建：a)利用氯仿提取睾丸组织中的RNA；b)将提取出的RNA进行RNA的琼脂糖凝胶电泳，应用核酸蛋白浓度测定仪Nanodrop 2000测260/280nmOD值及浓度；c)参照TransScript One‑Step gDNA Removal and cDNA Sythesis Super Mix试剂盒说明书中方法进行反转录(RT)，得到cDNA第1链；d)利用氯仿与酚提取睾丸组织DNA；c)cDNA池的构建：100个体RNA经质量检测合格后，反转录为cDNA，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后随机每10个个体cDNA样本混合，共构建10个cDNA混池。S3 PCR扩增：以NCBI所公布的绵羊mRNA(XM_012136817.2)序列为参考，利用Primer 5.0软件设计能够扩增包含绵羊SPATA6基因第7外显子区域的PCR引物，对S3中的cDNA进行PCR扩增；S4产物测序与单核苷酸多态性分型：将S3中混池扩增的PCR产物双向测序；将质量和浓度检测合格的299个DNA样品，统一稀释至50ng/μL，分装至1mL的离心管中，提供此单核苷酸多态性位点上下游各15bp DNA序列的具体信息，应用荧光多重酶连接反应技术对299个样品进行SNP分型；S5绵羊SPATA6基因单核苷酸多态性位点的频率统计及其与睾丸表型的关联分析。