[发明专利]不同类型样品中根肿菌的定量检测方法

摘要

本发明提供不同类型样品中根肿菌的定量检测方法。所述方法包括：提取DNA，包括质粒、休眠孢子、带菌土壤、十字花科植物带菌根组织及种子。利用荧光定量PCR技术对不同样品中的根肿菌ITS区基因片段进行检测，建立样品中根肿菌数量与Ct值之间的回归方程。利用统计学软件对不同样品回归方程拟合，获得适用于不同样品的通用模型及方程，实现利用通用模型评估不同样品中根肿菌的定量检测。本发明利用分子生物学技术，结合数学统计分析方法，拟合定量检测的通用模型，达到精准评估不同样品中根肿菌数量目标，具有节约试验成本、缩短检测时间等特点，为十字花科根肿病的早期诊断和流行预警及防控等方面提供技术手段和理论参考。

主权项

1.不同类型样品中根肿菌的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：A、构建含有根肿菌ITS基因片段的质粒，转化感受态细胞，获得转化子，提质粒，将质粒稀释成不同浓度，分别以不同浓度的质粒为模板，利用扩增ITS基因片段的引物进行实时荧光定量PCR检测，以质粒拷贝数浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标建立回归方程；B、提取一定数量的根肿菌休眠孢子总DNA，将DNA按照10倍梯度稀释成不同浓度，分别以不同浓度的DNA为模板，利用步骤A的引物进行实时荧光定量PCR检测，以孢子浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标建立回归方程；C、提取携带定量根肿菌的土壤总DNA，将DNA稀释成不同浓度，分别以不同浓度的DNA为模板，利用步骤A的引物进行实时荧光定量PCR检测，以孢子浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标建立回归方程；D、提取携带定量根肿菌的植物根组织总DNA，将DNA稀释成不同浓度，分别以不同浓度的DNA为模板，利用步骤A的引物进行实时荧光定量PCR检测，以孢子浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标建立回归方程；E、提取携带定量根肿菌的植物种子总DNA，将DNA稀释成不同浓度，分别以不同浓度的DNA为模板，利用步骤A的引物进行实时荧光定量PCR检测，以孢子浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标建立回归方程；F、利用统计软件综合分析，对步骤A～E中数据及所建回归方程进行整体拟合，建立适用于多种样品中根肿菌检测的通用模型及回归方程；G、提取待测样品的总DNA，利用步骤A的引物进行实时荧光定量PCR检测，将检测结果代入步骤F所建通用模型及回归方程，从而实现对待测样品中根肿菌数量的评估和定量检测；其中，步骤G中所述待测样品包括根肿菌的休眠孢子、带菌土壤、带菌根组织、带菌种子；步骤D和E中所述植物为十字花科植物。