[发明专利]一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存和解冻方法

摘要

本发明公开了一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存和解冻方法，属于胚胎保存技术领域。本发明的抗应激冻存方法包括如下步骤：(1)抗应激冷冻液的配置；(2)胚胎透明带的削薄；(3)将削薄的胚胎放入冷冻平衡液中平衡，待胚胎恢复至原体积80％，将其转入到冷冻液中在不同液滴间清洗转移，并控制在1分钟之内将胚胎放入到载杆上，迅速浸入到液氮中。本发明通过对透明带进行削薄，配合抗应激冷冻液的使用，能显著提高胚胎冷冻复苏率，保护冷冻胚胎的发育潜能及降低妊娠后的流产率。

主权项

1.一种结合透明带削薄的小鼠胚胎抗应激冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)抗应激冷冻液的配置：所述抗应激冷冻液包括冷冻平衡液和冷冻液；所述冷冻平衡液采用HTF为基础液，添加体积百分比为7‑8％的EG，体积百分比为7‑8％的DMSO，体积百分比为11‑13％的HSA，150‑250um/L维生素C和90‑100um/L维生素E；所述冷冻液采用HTF为基础液，添加体积百分比为12‑16％的EG，体积百分比为13‑16％的DMSO，0.5M蔗糖，体积百分比为10‑15％的HSA，150‑250um/L维生素C和90‑100um/L维生素E；(2)胚胎透明带的削薄：小鼠体内受精后第三天卵裂期进行胚胎透明带削薄，取第三天6‑10细胞期的胚胎，将胚胎用标尺标注并平均划分为四个区域，将其中一个区域的透明带用激光破膜仪在透明带中部将其削薄，总的削薄区域占胚胎的四分之一，其中激光脉冲宽度0.200ms，孔径2‑3um，采用连续激光进行削薄，分三次将透明带削薄四分之一，每次削薄时要调节脉冲轨迹使其与透明带的弧度相吻合，每次连续进行6个脉冲激光削薄，最后在削薄区域的两端将透明带切断；(3)将削薄的胚胎放入冷冻平衡液中平衡，待胚胎恢复至原体积75‑85％，将其转入到冷冻液中在不同液滴间清洗转移，并控制在1分钟之内将胚胎放入到载杆上，迅速浸入到液氮中。