[发明专利]一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法

摘要

本发明公开了一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，包括以下步骤：外植体的获取、农杆菌的活化、农杆菌侵染与共培养和诱导芽分化及生根。本发明以卷丹百合无菌小鳞片2~3mm薄层切片为转化材料，通过培养基改良和农杆菌菌液浓度及侵染时间的优化，建立了卷丹百合的高效遗传转化体系。卷丹百合瞬时转化效率为80%以上，稳定转化率为25.00%以上，转化效率高、不易染菌、不易产生嵌合体。本发明解决了以无菌小鳞片为外植体或单纯利用tTCL技术，获得卷丹遗传转化效率低的问题；同时克服了以卷丹愈伤组织为转化受体，由于愈伤组织对农杆菌过于敏感而最终无法获得转基因植株的缺陷，对农杆菌敏感型百合的遗传转化体系构建具有重要的指导意义和借鉴价值。

主权项

1.一种构建卷丹百合高效遗传转化体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养36~48 h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃，180~250rpm振荡培养24~36h后，再按体积比1:100加入YEB液体培养基活化，继续振荡培养约12h，至农杆菌菌液浓度OD₆₀₀值介于0.6~0.8后，离心收集菌体并用改良MS重悬液重悬稀释至OD₆₀₀值介于0.2~0.4，得到活化好的农杆菌菌液，备用；2）取无菌卷丹百合鳞茎的中层小鳞片，然后用解剖刀将所述中层小鳞片横切成2~3 mm的薄层切片，作为外植体；3）将步骤2）所述薄层切片放入步骤1）活化好的农杆菌菌液中浸染5～15min，使所述薄层切片与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干薄层切片表面多余的菌液后，再转入改良MS共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下培养3～4d，然后将其放入芽分化培养基中，每15d继代一次，待不定芽长至2~3cm后，再将其转入生根诱导培养基中诱导生根。