[发明专利]利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆

摘要

利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，属于基因工程技术领域，其特征在于：细胞克隆被分离纯化且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维；该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力；MSTN基因敲除载体靶位点已成功连接，未发生碱基突变；实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管，表明干扰MyoG基因后，细胞依然能够分化成为肌管，但总体肌管融合率降低，形态和数目较对照组有极显著差异。

主权项

1.利用Crispr/Cas9技术制备MyoG基因敲入和MSTN基因敲除的细胞克隆，其特征在于：所述的细胞克隆被分离纯化且经过2％马血清诱导分化后可以形成肌纤维；利用免疫荧光技术对牛骨骼肌卫星细胞进行鉴定，结果显示，CD34、Sca‑1、Desmin在牛骨胳肌卫星细胞中均呈阳性，随机计数100个细胞，3种抗体的阳性细胞高达98％以上；α‑actin、MHC及MyoG在诱导分化后的肌管中呈阳性表达，表明该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力；MSTN基因敲除载体：BbsI单酶切psPgRNA、pX330，酶切电泳的鉴定结果均与预期大小相符；分别按照预定的设计，合成针对第二外显子和第三外显子的两个靶点的sgRNA的引物，退火后与单酶切的psPgRNA、pX330质粒连接，共获得4个MSTN的敲除载体psPgRNA‑M‑A、pX330‑M‑A、psPgRNA‑M‑B和pX330‑M‑B，可确认靶位点已成功连接，未发生碱基突变；利用RNA干扰技术研究MyoG基因对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：在相差显微镜下观察细胞分化72h后所形成的肌管形态，实验对细胞分化72h后所形成的肌管数目及肌管融合率进行了统计分析，结果表明，实验组细胞经分化能够形成一定数目的肌管，与阴性对照组细胞相比，长肌管所占的比例及短小的肌管所占的比例均有显著差异，表明干扰MyoG基因后，细胞依然能够分化成为肌管，但总体肌管融合率降低，形态和数目较对照组有极显著差异；利用实时荧光定量PCR检测肌肉分化标志性基因MCK的表达变化：结果显示，无论是MyoG基因干扰组还是对照组，进入分化期间的细胞，MCK基因mRNA的表达量显著增加，且随着分化时间的增长，基因表达量呈极显著的上升趋势；但MyoG基因干扰组与对照组相比，MCK基因的表达显著降低。