[发明专利]一种真姬菇的原生质体制备方法

摘要

本发明提供一种真姬菇的原生质体制备方法，改变传统装有PDB培养基锥形瓶摇床培养产生球状菌丝提取原生质体方法，采样带玻璃渣的静置培养、定期摇瓶的培养菌丝及无菌尼龙网过滤方法，选取不同的菌丝菌龄、溶壁酶酶液浓度、酶解时间、过滤离心速率及时间等，并根据原生质体直径大小采用G2漏斗过滤原生质体等，吸取20ul滴于血球计数板上，在40倍的光学显微镜下镜检，计数，形成整套真姬菇原生质体制备方法。采用本发明方法，真姬菇原生质体数量达到1.0‑2.2×10⁷个/mL，满足真姬菇遗传转化等分子生物学的研究要求。

主权项

1.一种真姬菇的原生质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）接健壮真姬菇菌丝到PDA菌体培养基平板上，24℃避光培养144h‑240h；选择生长健壮的菌丝平板，接菌丝于带有玻璃渣的150mlPDB液体培养基中，玻璃渣大小为0.5‑1cm×0.4 cm×0.2cm，避光静置培养96h‑120h，培养48h后，每8h手动摇动锥形瓶10min，割断新长的菌丝；120h后转接50ml含有健壮菌丝的液体培养基到另外120ml带碎玻璃渣PDB液体培养基中，再次静置培养48h‑144h， 每8h于250rpm，24℃摇床培养1h；（2）在超净工作台内，用二层无菌尼龙纱布过滤出菌丝，用无菌水冲洗，接着用0.6mol/L甘露醇溶液清洗2次，用灭菌的滤纸吸干；用0.6mol/L甘露醇溶液配制的含1‑4wt.%溶壁酶的酶液，菌丝：酶液按1:10g/mL比例添加到装有菌丝体的离心管内，将离心管放入30℃水浴锅中酶解1‑4h，每30min，上下颠覆摇匀20次；（3）在超净工作台内，用G2漏斗过滤粗提液到离心管中并封口，在高速离心机3000‑6000rpm 条件下离心10min，倒掉上清液，用移液枪吸取5ml稳渗剂加入到离心管中，将沉淀混匀，重复3000‑6000rpm 条件下离心10min，倒掉上清，加1ml稳渗剂，将沉淀混匀；吸取20ul滴于血球计数板上，在40倍的光学显微镜下镜检，计数。