[发明专利]一种人体低剂量电离辐射损伤分子标志物牛磺酸的筛选与验证方法

摘要

本发明涉及一种人体低剂量电离辐射损伤分子标志物牛磺酸的筛选与验证方法。以一线工人作为低剂量辐射暴露组，以办公室人员作为对照组，基于非靶向代谢组学方法对低剂量辐射职业暴露人群进行低剂量辐射损伤分子标志物的筛选。筛选与验证了牛磺酸可作为人体低剂量辐射损伤的分子标志物，与其他辐射损伤分子标志物相比，牛磺酸更能系统反映职业人群低剂量辐射照射下的生物损伤效应；牛磺酸检测所使用的样本，如血液、尿液等，都较易获得，在应用中更具有实际意义，具有所需时间短、特异性强、可靠性高、环境风险小等多重优点。

主权项

1.一种人体低剂量电离辐射损伤分子标志物牛磺酸的筛选与验证方法，首先以一线工人作为低剂量辐射暴露组，以办公室人员作为对照组，基于非靶向代谢组学方法对低剂量辐射暴露人群进行低剂量辐射损伤分子标志物的筛选，其特征在于，然后基于非靶向代谢组学研究结果以及潜在低剂量辐射损伤分子标志物的相关生理学意义，进一步利用靶向代谢组学方法对筛选出的代谢物进行靶向定量验证，在此基础上利用非靶向和靶向代谢组学方法对两组人群血液中牛磺酸的表达水平进行统计分析，确认牛磺酸作为人体低剂量电离辐射损伤分子标志物，具体步骤包括：（1）对象纳入；（2）样本采集；（3）非靶向代谢组学初筛；（4）靶向代谢组学定量验证；（5）统计分析确定低剂量辐射损伤分子标志物，其进一步的措施是：所述对象纳入的具体方法为：以一线工人作为暴露组，以办公室人员作为对照组，两组人群在年龄和性别构成上相似，纳入标准：①该铀矿厂的全部工作人员；②铀矿山工人健康信息表问卷资料填写完整者；③收集到血液样本者；排除标准：①有糖尿病；②有严重血液系统疾病；③有长期服药史，所述样本采集的具体方法为：利用装有肝素钠抗凝剂的离心管进行空腹前，采集全血2 ml，采集后的血液样本在室温下3000 rpm离心5 min，取0.2 ml的上清液装于离心管中，共装4管，–80 ℃冰箱冻存，所述非靶向代谢组学初筛的具体方法为：上样前样本处理：将置于–80℃的样本在4℃下解冻后，移取100 μl样本至EP管中，加入300 μl甲醇以及10 μl内标，涡旋混匀30 s后，超声10 min，然后–20℃ 静置1 h，再于4℃条件下，将静置液13000 rpm离心15 min，取出200 μl上清于自带内插管的进样瓶中，②上机检测：色谱条件：采用Waters ACQUITY UPLC作为分析仪器，正离子模式流动相的组成为0.1%甲酸水溶液(A)‑乙腈(B)，负离子模式流动相组成为 5mM醋酸铵水溶液(A)‑乙腈(B)，洗脱梯度为：0 min，1% B；1 min，1% B；8min，99% B；10 min，99% B；10.1 min，1% B；12 min，1% B，流速为0.5ml/min，进样量为1 μl，质谱条件：采用Thermo Q Exactive Orbitrap对数据进行采集，正负离子喷雾电压分别为3.8和3.1 kV，毛细管温度为320 ℃，鞘气为40 arb，辅助气为15 arb，扫描范围为70‑1000，分辨率为70000，碰撞电压为20/40/60eV，③数据处理和物质验证：获得的质谱原始数据利用ProteoWizard软件转成mzML格式，再利用XCMS做保留时间矫正、峰过滤、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐，使用Compond Discoverer及OSI‑SMMS软件配合mzCloud数据库及自建数据库进行物质验证，④潜在效应生物标志物筛选及代谢通路分析利用两独立样本t检验计算暴露组和对照组代谢物的差异表达情况，用变化倍数来表示差异代谢物在暴露组水平与对照组相比是呈上升还是下降的趋势，研究差异代谢物的筛选标准为：p<0.05以及变化倍数小于0.82或大于1.2，将筛得的差异代谢物在生物信息数据库数据库、Human Metabolome Database数据库以及PubChem数据库中进行物质注释获取相应的ID号及相关信息，进一步将这些物质进行标注并进行代谢通路分析，⑤质量控制：在每个待测样本中各取20 μl混合成QC样本，再从QC样本中取200 μl上机检测以用来测定系统的稳定性，所述靶向代谢组学方法定量验证的具体方法为：①上样前样本处理：将置于–80℃的样本解冻后移取100 μl样本至EP管中，加入300 μl甲醇，涡旋混匀30 s后，–20 ℃静置1 h，然后于4℃条件下将静置液13000 rpm离心15min，取出200 μl上清于自带内插管的进样瓶中，进行后续高效液相色谱质谱分析，再分别取稀释10倍和200倍的上清液分别做高效液相色谱质谱分析，②标准溶液配制：配制标准液时分别准确称取相应量的标准品于10 ml容量瓶中配制成10 mmol/L的标准品储备液，然后再取相应量的标准品储备液于10 ml容量瓶中配制成混合标准溶液，最后依次稀释该标准溶液得一系列校准溶液，③上机检测：色谱条件：采用液相色谱仪作为分析仪器，柱温箱温度为35°C，样品盘设为4°C，进样量为1 μl，质谱条件：采用质谱仪，以多反应监测模式进行质谱分析，离子源参数如下：毛细管电压为+4000/‑3500 V, 喷雾电压为+500/‑500 V，辅助气温度为300℃，辅助气流速为5 L/min, 鞘气温度为250℃， 鞘气流速为11 L/min， 雾化器电压为45 psi，所述的统计分析确定低剂量辐射损伤分子标志物的具体步骤为：在非靶向代谢组学结果中，筛选的代谢物需要满足p<0.05以及变化倍数小于0.82或大于1.2，且在靶向代谢组学结果中，该代谢物均值在暴露组和对照组两组人群中有显著差异，即确认该代谢物是低剂量辐射损伤分子标志物，经非靶向代谢组学筛选和靶向代谢组验证，牛磺酸作为人体低剂量电离辐射损伤分子标志物。