[发明专利]一种牡丹分子育种方法

摘要

本发明涉及一种牡丹分子育种方法，首先将牡丹种子去皮，用次氯酸钠脱毒，用无菌赤霉素溶液浸泡24h后接种于MS培养基上，暗培养诱导3天再光照/黑暗交替培养30天。待子叶长出后，将子叶切碎后与含有外源基因的根癌农杆菌LBA4404共培养2天后洗去农杆菌，再经过诱导转基因抗性愈伤组织、分化，获得转基因苗，利用GUS染色进一步鉴定转基因苗，将阳性转基因苗放入壮芽培养基进行壮芽，最后经过生根，牡丹育种完成。本发明的方法显著缩短了种子萌发的时间，提高了转基因效果，并且为牡丹的分子育种提供了一种新技术、新方法。

主权项

1.一种牡丹分子育种方法，其特征在于包括牡丹种子的预处理和萌发、农杆菌的转化及共培养，诱导转基因抗性愈伤组织、诱导转基因抗性芽、壮芽、生根，具体步骤如下：(1)牡丹种子的预处理和萌发牡丹种子去皮后用NaClO处理8～10min，处理过程中不停地搅拌，使消毒完全，用无菌水洗涤5～6次；然后放于摇床上每隔20min换一次水，重复三次；将脱毒的种子浸泡在含300mg/L赤霉素的无菌溶液中24h；将赤霉素浸泡后的种子均匀放到MS培养基上，于22℃条件下暗培养三天，然后放在光照培养箱中光照/黑暗交替培养30天；交替培养时光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，光强为3000Lux，湿度为70％；培养30天后牡丹种子长出子叶；(2)农杆菌的转化及共培养将含有重组载体p3301的农杆菌LBA4404接种于含有卡那霉素的YEP液体培养基中放于28℃、180r/min的摇床上培养到OD600＝0.5～0.6，然后在4℃、6000r/min条件下离心10min，弃上清液，用诱导液重悬菌体得到菌悬液用于下一步浸染；在超净工作台中将步骤(1)MS培养基中的牡丹子叶取出，将其切碎后放入装有菌悬液的培养皿中浸染10min，再用灭菌滤纸吸干表面水分后将子叶碎片转入配置好的共培养基中于黑暗条件下共培养2天；子叶碎片转入共培养基时将子叶碎片反着放，子叶正面靠着培养基；(3)诱导转基因抗性愈伤组织在超净工作台中，将15μL灭菌的吐温和240μL、500mg/L的头孢霉素加到120mL灭菌的蒸馏水中，然后将共培养的子叶叶片取出放在里面浸泡洗涤5min，再用灭菌的蒸馏水洗5～9遍；最后用无菌滤纸吸干子叶叶片表面水分，放入诱导愈伤培养基上暗培养筛选并诱导抗性愈伤，每两周继代一次，培养20～30天；(4)诱导转基因抗性芽将长出抗性愈伤的牡丹叶片转入分化芽筛选培养基上，诱导其产生抗性芽，培养条件：光照/黑暗交替培养25～30天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux；(5)壮芽出芽后采用GUS染色鉴定阳性转基因芽，经GUS染色为蓝色的是阳性转基因芽，否则为阴性转基因芽；将阳性转基因芽切下，放入壮芽培养基中光照/黑暗交替培养7～10天，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，培养条件：温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux；(6)生根将长壮的芽切下放入生根培养基中培养15～20天，如果生根效果不明显，培养基中可以不加草铵膦；培养条件为光照/黑暗交替培养，光照、黑暗培养的时间分别为16h、8h，温度：白天22℃，夜晚18℃；湿度70％；光强3000Lux。