[发明专利]一种用于λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法

摘要

本发明公开了一种用于λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法。属于生物技术工程领域。本发明提供一种通用检测引物，其设计方法为在四环素tetRA基因中间约1/3处设计一对互补的引物，与原有的检测重组阳性的鉴定引物进行组合使用，分别用于检测以四环素基因tetRA为替换基因的λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的3’端序列和5’端序列。这样设计检测引物使检测重组阳性克隆有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测重组阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。

主权项

1.一种以四环素抗性基因tetRA为替换基因的λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的检测方法，其特征在于，包含如下步骤：（1）设计引物：从NCBI数据库获得tetRA基因序列和待敲除的基因H的序列，设计一对引物H‑tetRAR和H‑tetRAF用于扩增同源重组序列，每一条引物的5’端有35～60bp，分别为待敲除的基因H上下游同源序列a或a’片段，其序列长度均L1，3’端分别为四环素抗性基因tetRA两侧自带的引物序列b或b’片段， 四环素抗性基因tetRA的序列长度为L；设计用于鉴定基因是否重组的鉴定引物JC‑HF和JC‑HR，其序列分别位于待敲除的基因H上下游同源序列a或a’片段的外侧的c或c’片段，引物JC‑HF和JC‑HR的序列长度均为L2；设计两条互补的通用引物TYJC‑tetRAF和TYJC‑tetRAR，通用引物的序列为四环素抗性基因tetRA内部的d片段，四环素抗性基因tetRA上从序列b至d之间的序列长度为L3，四环素抗性基因tetRA上从序列d’至b’之间的序列长度为L4；（2）含tetRA基因的DNA片段的扩增；（3）感受态细胞的制备；（4）电转及目的菌株的筛选与鉴定；用鉴定引物JC‑HF和JC‑HR检测筛选的目的菌株，目的片段长度理论值=L2+L1+L+L1+L2；用JC‑HR和TYJC‑tetRAF检测筛选的目的菌株，目的片段长度理论值= L1+L2+L4，用JC‑HF和TYJC‑tetRAR检测筛选的目的菌株，目的片段长度理论值= L1+L2+L3；如果分别用JC‑HF和JC‑HR、JC‑HR和TYJC‑tetRAF或JC‑HF和TYJC‑tetRAR 3对引物检测筛选的目的菌株获得的PCR扩增的片段长度与目的片段长度理论值接近，表明tetRA基因打靶片段已经成功的将待敲除的基因H敲除。