[发明专利]一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法

摘要

本发明公开了一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：S1原料选取、S2扩增纯化、S3质检筛选、S4确定拷贝数、S5荧光测定、S6测定结果；本发明的有益效果是：通过特异性引物Lactobacillusplantarum‑R、Lactobacillusplantarum‑F与Lactobacillusparacasei‑F、Lactobacillusparacasei‑R，进而大量扩增出所需的两种目的基因；通过利用搭载不同目的基因的大肠杆菌显色不同，方便后期确定拷贝数；通过利用随着反应中双链DNA变性，荧光染料又恢复到游离状态导致荧光信号降低的这一特性，当达到特征峰温度时，特异产物与其它产物区分开，进而可以确定具体产物。

主权项

1.一种检测发酵豆乳中复合益生菌比例的荧光定量PCR方法，其特征在于：包括以下步骤：S1原料选取：选取实验室自制的发酵豆乳中的植物乳杆菌、副干酪乳杆菌，同时针对植物乳杆菌、副干酪乳杆菌中的目的基因分别筛选特异性引物F与R，并选取载体质粒；S2扩增纯化：将扩增所用反应试剂置于PCR仪中，按照预变性、变性、退火、延伸，分别扩增S1中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌中的目的基因，同时采用PCR试剂盒分别对扩增出的植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因进行纯化；S3质检筛选：利用T‑A克隆法将S2中扩增纯化后目的基因分别与S1中选取的载体质粒连接，同时将转入目的基因的载体质粒转化到大肠杆菌中，并通过LB培养基进行扩增培养，培养72‑86h后通过培养皿上蓝白斑筛选出显色单菌落，运用质粒盒分别提取筛选出的显色单菌落的质粒，针对提取出的质粒分别进行测序。S4确定拷贝数：将S3中测序鉴定无误后的质粒分别通过紫外分光光度计测定质粒OD₂₆₀的值，通过拷贝数公式将测定的质粒浓度通过标准曲线转化为拷贝数(copies/μL)S5荧光测定：a.主混液配制：选用16.5μL的2x ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix，0.8μL的5μM引物F(5uM)，0.8μL的5μM引物R(5uM)，2μL的T emplate(DNA)；b.PCR扩增循环：95℃条件下预变性5min，95℃条件下变性5s，56℃条件下植物乳杆菌中目的基因退火30s或52℃条件下副干酪乳杆菌中目的基因退火30s，72℃条件下延伸40s，将上述步骤循环40次；c.将所得的两种样本置于96孔板上在荧光定量PCR仪中进行反应；S6测定结果：测定S5中植物乳杆菌与副干酪乳杆菌的基因荧光PCR扩增曲线和熔解曲线，同时。