[发明专利]一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法

摘要

本发明涉及动物细胞提取方法，旨在提供一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法。提供一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法，包括：对小鼠肝脏静脉灌流、冲洗后，剪碎进行解离和消化；过滤后多次离心处理，对所得沉淀进行裂解以完全去除红细胞；终止裂红后再次离心处理；弃上清，得到纯净肝脏全免疫细胞。本发明能够在保证细胞纯度的基础上尽可能多地去除肝脏实质细胞，分离出高得率的小鼠肝脏全免疫细胞。与现有技术中研磨法分离的结果相比，本发明分离的小鼠肝脏全免疫细胞得率在大于5×106/只，高于研磨法得率的1～2.5×106/只，且细胞活率大于95％，大于传统研磨法细胞活率约85％。

主权项

1.一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜小鼠尸体，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部；分离出小鼠肝脏，保留胆囊和至少1厘米长度的主血管；(2)以磷酸盐缓冲液经肝门静脉持续灌流、冲洗肝脏，清除内部血液使肝脏从血红色变为白色；(3)剥离胆囊和主血管，将肝脏置于含有磷酸盐缓冲液的培养皿内浸洗；(4)将肝脏剪碎后置于含有4.7毫升改良杜氏伊格尔培养基和0.3毫升酶混合液的解离管内；(5)将解离管放入德国MACS公司GentleMACS^TMDissociator解离机器中，以m_liver_03模式运行两次；(6)取出解离管，置于37℃恒温、220转/分钟转速的摇床上消化30分钟；(7)消化结束后，将解离管再次置于解离机器中，以m_liver_04模式运行两次；(8)将解离管内混悬液以100微米滤器过滤到50毫升离心管内，用5毫升磷酸盐缓冲液重悬解离管内残留物后，再次将液体部分过滤至离心管内；(9)在室温条件下，以相对离心力300g离心处理10分钟；(10)弃掉上清液后，向沉淀内加3毫升36％Percoll细胞分离液；在室温条件下，以相对离心力600g离心处理15分钟；(11)弃掉包含肝细胞碎片的上清液，并向沉淀内加入2毫升红细胞裂解液裂解3分钟以完全去除红细胞；然后加入5ml磷酸盐缓冲液终止裂红，在4℃条件下以相对离心力400g离心处理5分钟；弃上清，得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞。