[发明专利]一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法

摘要

本发明涉及一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，属于分子生物学领域，具体步骤为：RNA提取；反转录cDNA合成；根据肌动蛋白基因、3‑磷酸甘油醛脱氢酶基因、苹果酸脱氢酶、β‑微管蛋白基因、18S核糖体RNA基因和泛素基因6个候选内参基因的核苷酸序列分别设计定量引物；荧光定量分析；数据分析后筛选出表达稳定的内参基因和内参基因组合。本发明通过分析各候选参考基因的表达变化，筛选出相对稳定的基因作为内参基因，为研究黄草乌基因表达水平的变化奠定良好基础，将有助于在黄草乌基因表达研究中获得可靠的标准化qRT‑PCR数据。

主权项

1.一种黄草乌实时定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于：具体步骤为：/n1）RNA 提取：黄草乌组织经液氮冷冻后再研磨，采用trizol法提取总RNA；/n2）反转录cDNA合成：将样品RNA反转录合成第一链，反转录体系为20µL，获得的产物直接使用或-80℃冰箱贮藏备用；/n3）引物设计：根据肌动蛋白基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因、苹果酸脱氢酶、β-微管蛋白基因、18S核糖体RNA基因和泛素基因6个候选内参基因的核苷酸序列分别设计定量引物；/n4）荧光定量：以cDNA为模板，稀释5个梯度，每个梯度5倍，即模板浓度分别为初始浓度的1、1/5、1/52、1/53、1/54倍进行实时荧光定量分析；/n5）数据分析：读取荧光定量PCR的CT值，根据公式Q=EΔCT进行计算出各基因的相对表达量Q值，其中E是基因的扩增效率，采用Bestkeeper、GeNorm和Norm-finder软件对6个候选内参基因在黄草乌组织的表达稳定性进行分析，Bestkeeper软件直接采用基因表达Ct值进行分析，而GeNorm和Norm-finder软件将Ct值经ΔCt方法转换后进行数据分析，筛选出表达稳定的内参基因和内参基因组合。/n