[发明专利]一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法及其应用

摘要

本发明公开了一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法及其应用。该方法包括如下步骤：(1)根据待测RNA的长度，每隔100bp设置一条DNA探针；(2)将细胞用1～3％(v/v)的甲醛溶液交联固定细胞后进行超声破碎，得到核酸的长度范围为100～500nt细胞裂解液；(3)加入DNA探针进行杂交，再对目标RNA进行富集，洗涤，纯化，得到RNA碎片；(4)将RNA碎片的3’末端和RNA接头连接，然后将产物逆转录成cDNA，再将cDNA的3’末端与DNA接头连接，得到目标RNA与其相互作用RNA的文库；(5)对文库进行扩增，再进行检测分析。该方法能够用于对低含量的相互作用RNA进行文库构建。

主权项

1.一种高效研究RNA相互作用组的高通量测序方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计DNA探针：根据待测RNA的长度，每隔100bp设置一条DNA探针；其中，DNA探针为3’末端带有生物素修饰的DNA探针，DNA探针中GC％的含量为45％，其长度为20个核苷酸；(2)超声破碎：将细胞用1～3％(v/v)的甲醛溶液交联固定细胞后，加入裂解缓冲液进行超声破碎，得到细胞裂解液；其中，细胞裂解液中核酸的长度为100～500nt；(3)探针和RNA杂交：将步骤(1)设计的DNA探针加入到步骤(2)中得到的细胞裂解液中，并加入两倍细胞裂解液体积的杂交缓冲液进行杂交，待杂交结束后加入磁珠对目标RNA进行富集，洗涤，解交联，并使用DNA酶和碱性磷酸酶去除DNA与磷酸基团，得到纯化后的RNA碎片；(4)两步接头连接及构建文库：将步骤(3)中得到的纯化后的RNA碎片的3’末端和RNA接头进行连接反应，得到RNA偶联接头产物；然后将RNA偶联接头产物逆转录成cDNA，再将cDNA的3’末端与DNA接头进行连接反应，得到目标RNA与其相互作用RNA的文库；(5)对步骤(4)中得到的目标RNA与其相互作用RNA文库进行扩增，再进行检测和分析。