[发明专利]利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法在审
| 申请号： | 201910616959.0 | 申请日： | 2019-07-09 |
| 公开（公告）号： | CN110305866A | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 朱传龙;胡平平;李毓雯;宁琴;罗小平;李军;岳明 | 申请（专利权）人： | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/90;C12N5/10 |
| 代理公司： | 南京科知维创知识产权代理有限责任公司 32270 | 代理人： | 杜依民 |
| 地址： | 210029 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明提供一种利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法。利用Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，以EFTUD2基因外显子exon3为待敲位点设计合成两条sgRNA并构建质粒载体，将两条质粒载体电转入HepG2.2.15细胞中，经流式分选单克隆培养，获得EFTUD2单等位基因敲除HepG2.2.15细胞模型。本发明的建立的EFTUD2单等位基因敲除HepG2.2.15细胞株，对于研究EFTUD2基因在抵抗HBV感染中的作用及其作用机制具有重要意义。 | ||
| 搜索关键词： | 等位基因 敲除 细胞株 技术构建 单克隆培养 基因外显子 构建质粒 位点设计 细胞模型 质粒载体 重要意义 作用机制 分选 流式 合成 转入 抵抗 细胞 基因 研究 | ||
【主权项】：
1.一种利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）靶点设计：选取EFTUD2 基因中可兼顾多个转录本的公共编码区的3号外显子为待敲位点，进行靶点设计，得到SEQ ID NO.2所示的靶点序列及SEQ ID NO.3所示的sgRNA序列，并设计合成EFTUD2 sgRNA1 oligo F/R和EFTUD2 sgRNA2 oligo F/R；（2）鉴定引物合成：针对靶点上下游200～400bp区域分别设计并合成SEQ ID NO.5所示的正反向PCR鉴定引物EFTUD2‑F/R；（3）载体构建：采用携带Cas9的真核表达PX458质粒，采用限制性内切酶Bbs I酶切PX458质粒，并利用T4连接酶将EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R、EFTUD2 sgRNA1 oligoF/R导入PX458质粒，构建PX458‑EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458‑EFTUD2 sgRNA2质粒载体；（4）质粒转染：提取PX458‑EFTUD2 sgRNA1质粒载体、X458‑EFTUD2 sgRNA2质粒载体转染HepG2.2.15细胞，并将转染后的HepG2.2.15细胞加入到细胞培养皿中培养；（5）流式分选：转染后 48 小时胰酶消化收集细胞，将细胞分散为单细胞悬液，使用流式细胞仪以绿色荧光蛋白为信号进行分选；（6）单克隆逐步扩大培养：分选收集的绿色荧光蛋白阳性细胞以1细胞/孔的密度接种至96孔板，4天换液一次，培养2周，成活的细胞长成单克隆细胞团，消化传至48孔板，逐步扩大培养；（7）鉴定：各克隆基因组DNA，利用SEQ ID NO.5所示的鉴定引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定；通过与基因原序列比对筛选出EFTUD2基因敲除的阳性克隆株；提取细胞总蛋白，并采用Western‑ blotting 鉴定 EFTUD2 蛋白的表达。
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