[发明专利]一种验证CRISPR-Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法

摘要

验证CRISPR‑Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，步骤：S1、测定产朊假丝酵母染色体倍数；S2、构建带Cas9片段的产朊假丝酵母表达载体；S3、构建含tRNAGlu基因、sgRNA下游表达单元的sgRNA初步质粒；S3、选定预敲除和靶点序列，在靶点及互补序列5’端加粘性末端，退火成双链，与初步质粒结合成sgRNA成熟重组质粒；S5、构建含敲除序列的重组供体片段；S6、sgRNA成熟重组质粒转化带Cas9片段的产朊假丝酵母；S7、成熟重组质粒和供体转化携带Cas9的产朊假丝酵母；检测敲除或敲除并引入外源基因的基因表达变化或表型变化验证Cas9介导产阮假丝酵母基因敲除是否可行。

主权项

1.一种验证CRISPR‑Cas9系统敲除产朊假丝酵母目标基因的可行性的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、测定产朊假丝酵母染色体的倍数；S2、使用限制性核酸内切酶对酵母Cas9表达载体和第一产朊假丝酵母游离型表达载体进行双酶切，并连接产生的Cas9片段和游离型表达载体骨架片段，获得重组质粒pCGGαAL‑Cas9；S3、扩增产朊假丝酵母编码谷氨酸的转运RNA(tRNA_Glu)基因、sgRNA下游表达单元，并分别引入IIS类限制性核酸内切酶酶切位点，tRNA_Glu基因与sgRNA扩增产物通过酶切位点进行重叠PCR连接；重叠后的片段以及第二产朊假丝酵母游离型表达载体经双酶切后连接在一起，获得载体pGlu‑sgRNA。S4、根据预敲除序列选择靶点识别序列，分别在靶点序列及互补序列的5’端加上IIS类限制性核酸内切酶产生的粘性末端，经退火形成带有5’突出粘性末端的双链片段，将双链片段与II S类限制性核酸内切酶酶切载体pGlu‑sgRNA后获得的骨架连接，获得重组质粒pGlu‑sgRNA‑预敲除序列；S5、构建含有敲除序列的同源重组供体基因片段；S6、重组质粒pGlu‑sgRNA‑预敲除序列转化携带重组质粒pCGGαAL‑Cas9的产朊假丝酵母，经过测序验证或PCR鉴定或预敲除序列的基因表达水平测定，验证是否敲除成功，初步验证Cas9介导敲除产阮假丝酵母的目标基因是否可行；S7、重组质粒pGlu‑sgRNA‑预敲除序列和重组供体片段转化携带重组质粒pCGGαAL‑Cas9的产朊假丝酵母，经过测序验证或PCR鉴定或供体的基因表达水平测定进一步验证Cas9介导的产阮假丝酵母基因敲除是否可行。