[发明专利]一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法

摘要

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，包括以下步骤：(1)紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株；(2)生产高纯度烟酰胺：a、一级种子液的制备；b、二级种子液的制备；c、发酵培养，待OD₆₀₀达到50‑70时，补加诱导剂，待酶活降低后停止反应；d、水合反应：所得反应液和水加入反应釜，反应温度20‑25℃，缓慢滴加3‑氰基吡啶，滴加完后继续反应。本发明通过对特定的枯草芽孢杆菌进行紫外诱变，进而筛选出高表达腈水合酶菌株，并通过特定的发酵及优化的催化反应，得到副产物烟酸含量低于10ppm的烟酰胺水溶液，产品纯度高、收率高，原料溶剂低廉，经济性好，反应温和，污染小，适合工业化生产。

主权项

1.一种枯草芽孢杆菌腈水合酶生产高纯度烟酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)紫外诱变筛选高表达腈水合酶菌株a、取对数生长期的枯草芽孢杆菌平铺于90mm的无菌培养皿，置于30w紫外灯下20cm处，分别在避光条件下照射处理30s、40s、50s、60s、90s、120s；b、照射后的培养皿放置在37℃培养箱中，静置1小时，将培养的菌液均匀涂布在LB固体培养基上，37℃静置培养2天，生长的单菌落用于发酵摇瓶筛选；c、挑取若干单菌落，接种于诱导培养基；d、通过SDS‑PAGE检测筛选获得高表达腈水合酶菌株；(2)生产高纯度烟酰胺a、一级种子液的制备：将经步骤(1)得到的高表达腈水合酶菌株自平板上培养后接种至培养基装液量为40mL的一级种子液摇瓶中，25℃‑35℃摇床培养12‑48h，摇床转速150‑300rpm，得一级种子液；b、二级种子液的制备：将培养好的一级种子按5‑20％接种量接入培养基装液量为250mL的二级种子液摇瓶中，25℃‑35℃摇床培养12‑48h，摇床转速150‑300rpm，得二级种子液；c、发酵培养：在10L发酵罐中加入1‑5L的发酵培养基，所述发酵培养基组成为：乳糖1‑5％(g/mL)、KH₂PO₄ 0.01‑0.2％(g/mL)、K₂HPO₄·3H₂O 0.01‑0.2％(g/mL)、MgSO₄·7H₂O 0.01‑0.05％(g/mL)、酵母粉0.1‑1％(g/mL)、氯化铵0.1‑1％(g/mL)、尿素0.1‑1％(g/mL)、诱导剂1‑5mL/L，其余为水，pH6.5‑7.5；121℃实罐消毒10‑30min，以5‑20％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度25‑35℃条件下，发酵周期72‑96h，培养过程中，每隔4‑6h取样，测定OD值和pH值变化，pH值控制6.5‑7.5，待OD₆₀₀达到50‑70时，补加诱导剂，待酶活降低后停止反应；d、水合反应：将上述反应结束后所得反应液和水加入反应釜，控制反应温度20‑25℃，缓慢滴加3‑氰基吡啶，滴加完后继续反应，直至反应结束。