[发明专利]一种细胞内pH的检测方法

摘要

本发明涉及一种细胞内pH测定方法，以i‑motif结构为响应pH元件的，通过在i‑motif连接一对荧光共振能量转移（FRET）荧光对，i‑motif与镧系有机金属框架片层结合淬灭正电荷荧光，随后i‑motif与质子响应后，从片层解离，产生荧光共振能量转移，通过两种荧光的共定位及颜色变化实现细胞内pH的测定。本发明设计i‑motif两端标记一对FRET对，采用镧系金属有机框架纳米层淬灭带正电的TAMRA荧光，保留另一种带负电的FAM荧光。本发明的方法具有较好的光稳定性、抗干扰性，检测具有极佳的时间和空间分辨率，可快速对胞内细胞转染等生理过程中pH变化定量检测。

主权项

1.一种细胞内pH的检测方法，其特征在于，以i‑motif结构为响应pH元件的，通过在i‑motif结构DNA连接一对荧光共振能量转移（FRET）荧光对，i‑motif结构DNA与镧系有机金属框架片层结合淬灭正电荷荧光，随后i‑motif结构DNA与质子响应后，从片层解离，产生荧光共振能量转移，通过两种荧光的共定位及颜色变化实现细胞内pH的测定，包括以下步骤：（1）i‑motif结构DNA与镧系金属有机框架纳米片层孵育：2 μL 15~30 μM i‑motif线性ss‑DNA，包括核酸序列表Seq. No.1‑4的 DNA 1‑4与0.2 mg/mL 镧系金属有机框架纳米片层（MOF‑La）,在1 mL 10 mM磷酸盐缓冲液I（PBS I）混合均匀，于室温孵育10 min，得到i‑motif+MOF‑La复合物，其中，PBS I为100 mM Na Cl、4 mM Mg Cl₂；（2）细胞内pH测定：细胞以合适的密度种于六孔板，培养1‑2天后，弃去培养基，取20 μL i‑motif+MOF‑La复合物充分溶解于新鲜培养基后，与细胞孵育4 hr，使i‑motif+MOF‑La复合物被细胞充分摄取，随后，细胞采用10 mM缓冲液（PBS II）冲洗三次，所述PBS II为10 mM Na₂ HPO₄、2 mM K H₂PO₄、137 mM Na Cl、2.7 mM K Cl、250 mM 葡萄糖， pH 7.4；细胞采用含有10 μM尼日利亚菌素浓度的20 mM HEPES缓冲液（20 mM HEPES）处理30 min，所述的20 mM HEPES为：20 mM Na Cl、125 mM K Cl、0.5 mM Ca Cl₂、0.5 mM Mg Cl₂、5 mM 葡萄糖，pH 5.0~7.5；随后，细胞采用10 mM PBS II缓冲液冲洗三次，采用共聚焦显微镜对细胞成像。