[发明专利]一种胎盘底蜕膜间充质干细胞制备方法

摘要

本发明公开了一种胎盘底蜕膜间充质干细胞制备方法，涉及干细胞制备领域。本发明提供了胎盘来源底蜕膜间充质干细胞制备方法包括采集运输、分离、换液、传代、冻存、检测、存储全过程。本发明以胎盘底蜕膜为材料提取胎盘底蜕膜间充质干细胞，采用多种酶联合多步消化法法进行制备，提取过程中无需加入动物血清，能在较短的时间得到较多细胞，且细胞有很好的均一性，稳定性。整个培养周期短，能高效、安全的获得所需的胎盘底蜕膜来源的间充质干细胞。

主权项

1.一种胎盘底蜕膜间充质干细胞制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）胎盘采集：选取来自于医院正常生产的38‑40周足月的分娩的胎盘，采集后经生理盐水清洗胎盘上胎粪等后放入用含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的α‑MEM保护液中，4‑25℃保存，24小时内送达实验室，并采集母亲外周血进行艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、巨细胞病毒检测；（2）底蜕膜组织分离：在生物安全柜内，将胎盘靠近母亲面一侧的胎盘面朝上放入无菌托盘中，用无菌镊子去掉淤血并用生理盐水冲洗母亲面，用无菌手术弯剪刀剪取靠近母体一侧粗糙面的底蜕膜组织；（3）清洗、用无菌剪刀剪碎底蜕膜组织至0.5‑0.8cm³微小颗粒；（4）第一次消化：采用Ⅱ型胶原酶与Ⅳ型胶原酶混合消化组织；（5）第二次消化：采用分散酶进行消化；（6）终止消化：消化结束后加入等量完全无血清培养基终止消化，1600rpm，8min离心弃去上清；（7）去除红细胞：将细胞用生理盐水重悬，加入6wt%羟乙基淀粉去除红细胞；（8）计数测活、种瓶及培养；以无血清完全培养基重悬细胞，用台盼蓝拒染法计数测活；将获得的间充质干细胞按2×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶中，根据接种密度计算出接种的培养瓶数；用无血清完全培养基培养基，轻轻吹打重悬浮细胞后接种于相应T175培养瓶中，培养基中补加孕酮，放置到37℃、5%CO₂培养箱中培养；（9）换液：第3天进行更换无血清完全培养基，之后每隔3天进行全量换液；（10）传代：待细胞生长至融合度70‑80%时，用10ml生理盐水洗剂细胞1次，加入10mL 0.05%胰酶室温消化3min，用10ml无血清完全培养基进行终止消化，收集消化细胞；1200rpm，6min离心弃去上清，用无血清完全培养基重悬细胞按1:4进行传代种瓶；（11）收获、冻存：待细胞生长至融合度80%时，用10ml生理盐水洗剂细胞2次，加入10mL 0.05%胰酶消化3min，用10ml无血清完全培养基进行终止消化，收集消化细胞进行计数；从冰箱中取出提前配制20%的DMSO冻存保护液；根据细胞计数，按每根冻存管细胞数约为5×10⁶个细胞数，计算出细胞冻存的管数和体积；先在冻存管上做好标记，再用完全培养基将细胞定容到相应体积，吹打混匀，再缓慢加入同等体积、配制好的20%DMSO冻存保护液，混匀后将细胞分装到冻存管中，每管体积为1mL；所述20%DMSO冻存保护液使用前要放冰箱冷藏平衡至4℃；（12）程序降温及保存：将冻存管放入预冷的程序降温盒中，放入‑80℃冰箱过夜后，转入液氮正式储存；（13）检测：将干细胞进行细胞计数、活性检测、流式检测、诱导分化能力检测以及生长曲线测定。