[发明专利]一种Ube3a基因在Iso诱导的心肌肥大中的作用机制的研究方法

摘要

本发明涉及心脏医学技术领域，且公开了一种Ube3a基因在Iso诱导的心肌肥大中的作用机制的研究方法，通过细胞分组、Ube3a基因的获取、Ube3a腺病毒的包装、转染以及数据分析等步骤来观察Ube3a在Iso诱导心肌肥大的过程中表达量的变化情况，判断Ube3a是否与心肌肥大的发生有关连作用，然后通过Ube3a基因的敲除，确定Ube3a在心肌肥大发生过程中的特异性以及Ube3a对心肌肥大是促进还是阻止作用；通过Ube3a基因的过表达作用，进一步明确Ube3a的促进或者阻止作用，并结合Ube3a敲除和过表达后细胞的发展状况，确定Ube3a的作用和心肌细胞肥大之间的因果关系。通过本研究方法确定Ube3a基因能够抑制Iso诱导的心肌细胞肥大，而且MMP‑9蛋白参与了这一分子机制，为心肌肥大的预防和治疗提供了新的靶基因。

主权项

1.一种Ube3a基因在Iso诱导的心肌肥大中的作用机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞分组：细胞分组分为Iso诱导分组以及基因敲除和过表达分组，Iso诱导分组将细胞培养采用六孔板铺盘，每孔加入2ml细胞培养基，向对照组细胞培养基中加入2μl PBS作为安慰剂；Iso药物诱导组均加入2μl 10mM的Iso溶液，制成Iso终浓度为10μM的细胞培养基，按照时间梯度依次培养12h、24h、48h，基因敲除和过表达分组将细胞培养采用六孔板铺盘，每孔加入2ml细胞培养基，向阴性对照组加入2μl PBS作为安慰剂，敲除和过表达组中的对照组加入2μl PBS作为安慰剂，其他Iso诱导组制成Iso终浓度为10μM的细胞培养基，按照时间梯度依次培养12h、24h和48h；(2)Ube3a基因的获取：实验准备后，取出‑80℃冰箱中保存的大肠杆菌感受态细胞及Ube3a质粒置于冰上融化，再取一干净的EP管依次加入30ul感受态细胞和3ul质粒，用移液器反复吹打混匀后冰浴15min，将冰浴15min后的EP管插入水浴浮板并迅速放入提前预热至42℃的水浴锅中热激45s，再迅速放回冰上2min，向EP管中加入900μl LB液体培养基，放入37℃摇床，180rpm培养1h，查看培养物的浑浊度，在超净台中，根据培养的大肠杆菌细胞浑浊度，取一定量均匀地滴加在事先已经倒好板的含氨苄霉素LB固体培养基上，用涂布棒将菌液均匀地涂布开，置于生化培养箱中培养，待培养14‑18h后，查看菌落生长情况，如果菌落密度达到60％‑80％，终止生长，取数支干净的15ml试管，向试管中分别加入4ml LB液体培养基，分别挑取不同的单克隆菌落接种于不同试管中，于37℃摇床，180rpm培养12‑16h左右，小量质粒抽提；(3)Ube3a腺病毒的包装：实验先通过PCR扩增获得含有限制性内切酶酶切位点的Ube3a目的基因模板片段，然后通过内切酶将病毒载体双酶切，通过T4连接酶将目的片段组装到腺病毒载体中，构建重组Ube3a过表达腺病毒质粒，通过与骨架质粒的共转染，包装Ube3a过表达腺病；(4)转染：转染包含siRNA的转染以及腺病毒感染，siRNA的转染步骤为合成的siRNA粉末用DEPC处理过的无菌水溶解，配制成20μM的溶液，然后根据转染的细胞孔数计算需要配制的转染液，一般对于3.5cm直径的孔加入约7μl RNAiMAX和6μl合成的siRNA(3μl RNAi#1和3μl RNAi#2)溶液，腺病毒感染取5μl包装好的1010滴度以上的腺病毒溶液直接加入到2ml细胞培养基中，腺病毒将自行侵染细胞；(5)数据分析：数据通过使用SPSS16.0分析，组间的比较使用独立样本t检验分析，多组间的比较采用单因素Dunnett’s t检验(ANOVA Dunnett’s posthoc)，数据结果以Mean±SD表示，p<0.05表示有统计学上显著性差异。