[发明专利]一种利用巨大芽孢杆菌分离提取苯乙酸的方法

摘要

本发明的一种利用巨大芽孢杆菌分离提取苯乙酸的方法，包括：巨大芽孢杆菌活性粗提物的制备，硅胶柱层析，常压硅胶柱层析，将常压硅胶柱层析所分离物质进行Sephadex LH‑20凝胶柱色谱分离，洗脱组分以甲醇溶解，并用甲醇溶液反复洗脱后，收集洗脱液，后合并相似洗脱组分进行活性追踪洗脱，具有较强的抑菌活性组分继续分离，分离过程中洗脱组分均有肉眼可见的晶体析出，将其重结晶分别纯化晶体得到化合物即为苯乙酸。本发明底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低、培养基质容易获得。

主权项

1.一种利用巨大芽孢杆菌分离提取苯乙酸的方法，包括以下步骤：/n（1）粗提物的制备/n巨大芽孢杆菌菌体细胞经喷雾干燥制成菌粉备用，质量比为1:3的菌粉与重蒸工业乙醇加入提取罐中，浸泡30～50min后于60～100℃下回流加热4h，提取完成待其冷却后，采用6层纱布过滤除掉残渣，收集提取液，将提取罐中过滤掉的残渣再次加入等量重蒸工业乙醇，继续按照上述步骤进行回流提取，重复收集两次提取液后利用旋转蒸发仪进行减压浓缩至黏稠状即得巨大芽孢杆菌醇提物；对巨大芽孢杆菌醇提物进行初步分离，选用乙酸乙酯作为萃取剂，将醇提取物和水按1:2进行溶解，用分液漏斗作为萃取罐加入与水等体积的乙酸乙酯溶液进行振荡萃取，每次振荡时间为8~10min，静置15~20min，收集上层乙酸乙酯萃取液，流出的下层水溶液再次置于萃取罐中，再加入等体积乙酸乙酯继续萃取，重复此步骤4~5次，合并所有乙酸乙酯萃取液并利用旋转蒸发仪45℃进行减压浓缩至有机剂挥干，无水乙醇带水三次后冷冻干燥，得到巨大芽孢杆菌活性粗提物，保存备用；/n（2）硅胶柱层析/n取活性粗提物按体积比1:1加乙酸乙酯溶解，以体积比1:1.2比例吸附于40～80目硅胶中进行拌样，水浴挥干乙酸乙酯，充分搅拌均匀，直至硅胶复为干燥粉末状，取柱层析硅胶装柱（120cm），然后在硅胶层析柱上进行干法上样，以石油醚，石油醚:乙酸乙酯体积比为100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，乙酸乙酯:甲醇体积比为30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1，甲醇梯度洗脱，进行柱层析分离通过薄层层析色谱分析，Rf值、5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色综合判断组份相同洗脱液，分段收集、合并洗脱液，减压浓缩至有机剂挥干，得浓缩液；/n（3）常压硅胶柱层析/n将浓缩液与40~80目硅胶按质量比1:1.5进行拌样,待溶剂挥干完全后上柱，柱层析硅胶200~300目装柱，选择冲柱系统为石油醚、石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1、10:1，纯甲醇进行梯度洗脱；经TLC分析后合并相似洗脱组分，得到四个组分，对四个组分进行活性追踪发现其中两个具有较强的抑菌活性，因此对洗脱组分中这两个组分分别进行进一步分离得到目标物；/n（4）Sephadex LH-20 凝胶柱色谱分离/n将步骤（3）所分离物质进行Sephadex LH-20 凝胶柱色谱分离，洗脱组分以甲醇溶解，并用甲醇溶液反复洗脱后，收集洗脱液，通过TLC层析色谱及显色分析，经TLC分析后合并相似洗脱组分进行活性追踪洗脱，具有较强的抑菌活性组分继续分离，分离过程中洗脱组分均有肉眼可见的晶体析出，经TLC分析以及5%浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液显色观察发现洗脱组分所析出的晶体Rf值基本一致，判断是同一种物质，将其重结晶分别纯化晶体得到化合物即为苯乙酸。/n