[发明专利]白子菜对Ⅱ型糖尿病小鼠炎症因子影响机制的研究方法

摘要

白子菜对Ⅱ型糖尿病小鼠炎症因子影响机制的研究方法，本发明涉及糖尿病研究，将50只小鼠适应性喂养一周后，随机分为空白对照组和造模组，分别给予正常饲料和高脂高糖饲料喂养；喂养4周后，隔夜禁食不禁水12h，称重标记；注射STZ三天，隔夜禁食不禁水12小时，先用血糖仪和试纸预先实验，再用微量血糖仪监测小鼠尾尖血糖，测定，以空腹血糖大于等于11.1mmol/L作为II型糖尿病成模标准。通过高脂饮食配合链脲佐菌素腹腔注射复制II型糖尿病小鼠模型，评估小鼠给予白子菜鲜品干预后对炎症因子的影响，为白子菜治疗II型糖尿病和广西特色中草药进一步开发提供更清晰的理论。

主权项

1.白子菜对Ⅱ型糖尿病小鼠炎症因子影响机制的研究方法，其特征在于：它的操作步骤如下：(1)、预备实验材料(1.1)、实验药物准备：准备菊科三七属植物白子菜全草，并取其鲜品的地上部分2kg，加10倍量水，浸过药材，浸泡30分钟后煮沸1小时，趁热用七八层干净纱布倒出提取液，再放8倍水煮30分钟，再次趁热过滤，合并之前滤液混合并且摇均匀，浓缩已过滤的药液至约200ml，制成相当于每ml有10g生药的浓缩液；(1.2)、实验动物准备：昆明小鼠，雄性，体重20±2g，SPF级；(1.3)、实验试剂准备：准备如下试剂：链脲佐菌素、盐酸二甲双胍、甘油三酯试剂、总胆固醇试剂、低密度脂蛋白胆固醇试剂、Protein G Magnetic Beads、预染蛋白双色marker、TRIS、十二烷基硫酸钠、TEMED、过硫酸铵、化学发光试剂、30％丙烯酰胺制胶液、Tween‑20、高效RIPA组织/细胞快速裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PBS磷酸盐缓冲液；(1.4)、实验仪器准备：准备如下仪器：电泳仪、酶标仪、干式恒温器、离心机、微量移液枪、水浴锅、冰箱、全自动化学发光分析仪、UPT优普特实验室超纯水器、罗氏卓越金采血糖仪；(2)、操作实验进行，其操作步骤如下：(2.1)、造模：将50只小鼠适应性喂养一周后，随机分为空白对照组n＝6只和造模组n＝44只，分别给予正常饲料和高脂高糖饲料喂养；喂养4周后，隔夜禁食不禁水12h，称重标记，柠檬酸2.1g加入双蒸水100mL中配成A液，柠檬酸钠2.94g加入双蒸水配成B液，将A、B液按1:1混合，PH计测定PH值，调节PH＝4.2‑4.4，0.22微米滤菌器过滤，以该缓冲溶液配制1％浓度的STZ，避光，冰上操作，现配现用，造模组小鼠按体重一次性空腹腹腔注射链脲佐菌素100mg/kg，空白对照组小鼠仅空腹腹腔注射相同剂量的枸橼酸盐缓冲液；注射STZ三天，隔夜禁食不禁水12小时，先用血糖仪和试纸预先实验，检查电池及检测是否稳定，再用微量血糖仪监测小鼠尾尖血糖，测定，以空腹血糖大于等于11.1mmol/L作为II型糖尿病成模标准，不成模的造模组小鼠弃之，空白对照组喂以常规饲料,其他则继续喂以高糖高脂饲料；(2.2)、动物分组及药物干预：造模成功的小鼠按血糖再随机分成4组，即模型对照组、白子菜鲜品水提物高剂量组、白子菜鲜品水提物低剂量组和盐酸二甲双胍组；为提高成模小鼠的存活率，需要保持垫料干燥，干净，每日一换，避免阳光直射，加足水和饲料；模型对照组大鼠每日予以等量生理盐水4mL灌胃观察，高剂量白子菜组剂量为80g/kg，低剂量白子菜组剂量为40g/kg，盐酸二甲双胍组剂量100mg/kg每日给予灌胃干预治疗，灌胃体积为2mL/100g，给药后，分别于第0、5、15天测量小鼠体重，并记录小鼠饮水量，饮食量，连续给药15d，空白对照组给予正常饲料，其他组依旧给予高脂饲料；(2.3)、空腹血糖的测定：实验结束后，各组小鼠空腹12h，固定动物并露出鼠尾，剪尾尖出血,用安准型血糖仪检测其血糖；(2.4)、血脂检测：各组小鼠于给药15d后，用弯头镊夹摘取眼球，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入离心管采血，同时以左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度，在测血糖结束后，脱臼处死，全血3000rpm低温离心15min，分装血清,分别测定血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量；(2.5)、Western‑blot法检测肝组织炎症因子表达：将小鼠处死后，解剖小鼠，取出肝脏，将肝脏分为两份，一份剪花生米大小，不宜过小也不宜过大，长度约为0.5cm，然后放入固定液杯，固定液约为组织的10倍，常温放置即可，一份生理盐水清洗后，封膜，放入冷存管，直接放冻存管至‑80摄氏度的冰箱冻存；将用适当的裂解液裂解组织细胞，保持蛋白结构完整，收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度；为了方便电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子大小，使用蛋白预染蛋白质分子量标准；电泳结束后，从胶板上剥下胶，出去浓缩胶，切去一角做标记；剪切一张与凝胶大小相同的PVDF膜，先用甲醇浸润1‑3s，然后用重蒸水漂洗1‑2min，最后用转移缓冲液平衡10‑15min，使用Bio‑Rad标准湿式转膜装置，依次将下面物品铺于转移装置的夹板上，单层海绵、一张凝胶大小Whatman3MM滤纸、SDS‑PAGE凝胶、膜、一张凝胶大小Whatman3MM滤纸、单层海绵；滴加少许电转液以驱赶气泡，合上封紧后放入电转槽，放入转移槽，其中膜在正极，凝胶面位于负极；设定转膜电流300‑400mA，转膜时间30‑60min；转膜完毕后，将蛋白膜取出，用去离子水和PBST，漂洗1‑2min，以洗去膜上的转膜液；加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60min；将纤维素膜与第一抗体温育，冲洗后再封闭；接着与酶标第二抗体温育，最后加入酶促底物显色；(2.6)、统计学方法：用SPSS22.0软件对实验结果进行统计分析，计量资料以表示，组间采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD法，P＜0.05为差异有显著性；(3)、结果分析：(3.1)、白子菜对Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖水平的影响：白子菜干预后对Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖水平的变化与空白对照组比较，模型对照组小鼠FBG水平明显升高；与模型对照比较，给予白子菜鲜品高、低浓度组小鼠干预治疗后的糖尿病小鼠FBG明显降低；(3.2)、白子菜对Ⅱ型糖尿病小鼠血脂水平的影响：白子菜干预后对Ⅱ型糖尿病小鼠血脂水平的变化与空白对照组相比，TC、TG、LDL‑C含量显著升高；与模型对照组相比较，给予白子菜鲜品高剂量小鼠组干预治疗后TC、TG、LDL‑C含量均显著降低；(3.3)、白子菜对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏组织中炎症因子表达水平的影响：白子菜干预后对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏组织中炎症因子水平的变化与空白对照组相比，TNF‑α、TGF‑β1表达均明显升高；与模型对照组相比，在给予白子菜鲜品高剂量小鼠组干预治疗后TNF‑α、IL‑6、TGF‑β1这些炎症因子水平有明显的下调。