[发明专利]检测稻属细胞器基因组的方法

摘要

本发明公开了一种检测稻属细胞器基因组的方法，其步骤是：首先设计特异重复序列引物及参数；其次选取并制备模板DNA：选择稻属不同种材料，生长两周取幼苗液氮研磨提取总DNA；然后建立PCR扩增体系：标准PCR扩增反应体系为10μl，模版使用上一步中DNA；第四建立荧光定量体系：标准荧光定量PCR反应体系为10μl，模版使用第二步中DNA；第五是细胞器基因组重复序列构象检测与分析。本发明利用其特异性重复序列，建立了一套分子标记，可快速、准确地通过实验手段检测稻属细胞器基因组中重复序列构象的差异，进而区分不同来源的细胞质。此方法具有准确、高效、快速的特点，既可定性检测稻属细胞器基因组，也可以定量检测重复序列的构象差异。

主权项

1.一种检测稻属细胞器基因组的方法，其特征在于：包含如下步骤：/nA、制得稻属细胞器基因组特异重复序列PCR引物，如下所示：/n(1)MRS1ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；/n(2)MRS1ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；/n(3)MRS1cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；/n(4)MRS1cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；/n(5)MRS2ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；/n(6)MRS2ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；/n(7)MRS2cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.7所示；/n(8)MRS2cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.8所示；/n(9)MRS3ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.9所示；/n(10)MRS3ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.10所示；/n(11)MRS3cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.11所示；/n(12)MRS3cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.12所示；/n(13)MRS4ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.13所示；/n(14)MRS4ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.14所示；/n(15)MRS4cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.15所示；/n(16)MRS4cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.16所示；/n(17)MRS5ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.17所示；/n(18)MRS5ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.18所示；/n(19)MRS5cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.19所示；/n(20)MRS5cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.20所示；/n(21)MRS6ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.21所示；/n(22)MRS6ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.22所示；/n(23)MRS6cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.23所示；/n(24)MRS6cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.24所示；/n(25)MRS7ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.25所示；/n(26)MRS7ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.26所示；/n(27)MRS7cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.27所示；/n(28)MRS7cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.28所示；/n(29)MRS8ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.29所示；/n(30)MRS8ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.30所示；/n(31)MRS8cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.31所示；/n(32)MRS8cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.32所示；/n(33)MRS9ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.33所示；/n(34)MRS9ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.34所示；/n(35)MRS9cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.35所示；/n(36)MRS9cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.36所示；/n(37)MRS10ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.37所示；/n(38)MRS10ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.38所示；/n(39)MRS10cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.39所示；/n(40)MRS10cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.40所示；/n(41)MRS11ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.41所示；/n(42)MRS11ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.42所示；/n(43)MRS11cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.43所示；/n(44)MRS11cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.44所示；/n(45)MRS12ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.45所示；/n(46)MRS12ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.46所示；/n(47)MRS12cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.47所示；/n(48)MRS12cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.48所示；/n(49)MRS13ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.49所示；/n(50)MRS13ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.50所示；/n(51)MRS13cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.51所示；/n(52)MRS13cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.52所示；/n(53)MRS14ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.53所示；/n(54)MRS14ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.54所示；/n(55)MRS14cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.55所示；/n(56)MRS14cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.56所示；/n(57)MRS15ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.57所示；/n(58)MRS15ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.58所示；/n(59)MRS15cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.59所示；/n(60)MRS15cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.60所示；/n(61)MRS16ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.61所示；/n(62)MRS16ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.62所示；/n(63)MRS16cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.63所示；/n(64)MRS16cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.64所示；/n(65)MRS17ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.65所示；/n(66)MRS17ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.66所示；/n(67)MRS17cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.67所示；/n(68)MRS17cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.68所示；/n(69)MRS18ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.69所示；/n(70)MRS18ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.70所示；/n(71)MRS18cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.71所示；/n(72)MRS18cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.72所示；/n(73)MRS19ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.73所示；/n(74)MRS19ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.74所示；/n(75)MRS19cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.75所示；/n(76)MRS19cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.76所示；/n(77)MRS20ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.77所示；/n(78)MRS20ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.78所示；/n(79)MRS20cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.79所示；/n(80)MRS20cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.80所示；/n(81)MRS21ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.81所示；/n(82)MRS21ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.82所示；/n(83)MRS21cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.83所示；/n(84)MRS21cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.84所示；/n(85)CRS1ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.85所示；/n(86)CRS1ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.86所示；/n(87)CRS1cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.87所示；/n(88)CRS1cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.88所示；/n(89)CRS2ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.89所示；/n(90)CRS2ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.90所示；/n(91)CRS2cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.91所示；/n(92)CRS2cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.92所示；/n(93)CRS3ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.93所示；/n(94)CRS3ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.94所示；/n(95)CRS3cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.95所示；/n(96)CRS3cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.96所示；/n(97)CRS4ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.97所示；/n(98)CRS4ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.98所示；/n(99)CRS4cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.99所示；/n(100)CRS4cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.100所示；/n(101)CRS5ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.101所示；/n(102)CRS5ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.102所示；/n(103)CRS5cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.103所示；/n(104)CRS5cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.104所示；/n(105)CRS6ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.105所示；/n(106)CRS6ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.106所示；/n(107)CRS6cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.107所示；/n(108)CRS6cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.108所示；/n(109)CRS7ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.109所示；/n(110)CRS7ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.110所示；/n(111)CRS7cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.111所示；/n(112)CRS7cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.112所示；/n(113)CRS8ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.113所示；/n(114)CRS8ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.114所示；/n(115)CRS8cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.115所示；/n(116)CRS8cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.116所示；/n(117)CRS9ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.117所示；/n(118)CRS9ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.118所示；/n(119)CRS9cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.119所示；/n(120)CRS9cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.120所示；/n(121)CRS10ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.121所示；/n(122)CRS10ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.122所示；/n(123)CRS10cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.123所示；/n(124)CRS10cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.124所示；/n(125)CRS11ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.125所示；/n(126)CRS11ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.126所示；/n(127)CRS11cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.127所示；/n(128)CRS11cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.128所示；/n(129)CRS12ab-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.129所示；/n(130)CRS12ab-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.130所示；/n(131)CRS12cd-F正向引物，其序列如SEQ ID NO.131所示；/n(132)CRS12cd-R正向引物，其序列如SEQ ID NO.132所示；/n制备上述引物的参数如下：/nSEQ ID NO.1：扩增长度为552bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.3：扩增长度为704bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.5：扩增长度为542bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.7：扩增长度为514bp，退火温度为55℃；/nSEQ ID NO.9：扩增长度为483bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.11：扩增长度为386bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.13：扩增长度为366bp，退火温度为63℃；/nSEQ ID NO.15：扩增长度为365bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.17：扩增长度为344bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.19：扩增长度为261bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.21：扩增长度为445bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.23：扩增长度为324bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.25：扩增长度为322bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.27：扩增长度为364bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.29：扩增长度为258bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.31：扩增长度为296bp，退火温度为55℃；/nSEQ ID NO.33：扩增长度为242bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.35：扩增长度为160bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.37：扩增长度为345bp，退火温度为55℃；/nSEQ ID NO.39：扩增长度为192bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.41：扩增长度为183bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.43：扩增长度为149bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.45：扩增长度为227bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.47：扩增长度为195bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.49：扩增长度为202bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.51：扩增长度为202bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.53：扩增长度为504bp，退火温度为55℃；/nSEQ ID NO.55：扩增长度为448bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.57：扩增长度为222bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.59：扩增长度为277bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.61：扩增长度为264bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.63：扩增长度为374bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.65：扩增长度为356bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.67：扩增长度为324bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.69：扩增长度为147bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.71：扩增长度为158bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.73：扩增长度为169bp，退火温度为55℃；/nSEQ ID NO.75：扩增长度为252bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.77：扩增长度为1047bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.79：扩增长度为1127bp，退火温度为58℃；/nSEQ ID NO.81：扩增长度为382bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.83：扩增长度为273bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.85：扩增长度为327bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.87：扩增长度为261bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.89：扩增长度为203bp，退火温度为54℃；/nSEQ ID NO.91：扩增长度为202bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.93：扩增长度为211bp，退火温度为54℃；/nSEQ ID NO.95：扩增长度为196bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.97：扩增长度为187bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.99：扩增长度为312bp，退火温度为54℃；/nSEQ ID NO.101：扩增长度为205bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.103：扩增长度为306bp，退火温度为54℃；/nSEQ ID NO.105：扩增长度为179bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.107：扩增长度为187bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.109：扩增长度为206bp，退火温度为54℃；/nSEQ ID NO.111：扩增长度为164bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.113：扩增长度为201bp，退火温度为56℃；/nSEQ ID NO.115：扩增长度为175bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.117：扩增长度为211bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.119：扩增长度为165bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.121：扩增长度为191bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.123：扩增长度为126bp，退火温度为54℃；/nSEQ ID NO.125：扩增长度为184bp，退火温度为59℃；/nSEQ ID NO.127：扩增长度为187bp，退火温度为53℃；/nSEQ ID NO.129：扩增长度为183bp，退火温度为50℃；/nSEQ ID NO.131：扩增长度为183bp，退火温度为50℃；/nB、模版DNA的选取与制备：/n选择稻属材料：O.rufipogon,O.sativa,O.australiensis,O.barthii,O.brachyantha,O.glaberrima,O.glumipatula,O.longistaminata,O.meridionalis,O.nivara,O.officinalis,O.punctata，O.ridleyi,O.rhizomatis,O.minuta,O.malampuzhaensis,O.latifolia,O.grandiglumis,O.eichingeri,O.alta和O.longiglumis，生长两周后，每个材料取整株幼苗在液氮中研磨成粉状提取总DNA；/nC、PCR扩增体系的建立：/n标准的PCR扩增反应体系为10μl，组成如下：/n50ng/μl总DNA 1μl，2×PCR Mix 5μl，10pM的引物F 0.4μl，10pM的引物R 0.4μl，去离子无菌水3.7μl，反应混合物用矿物油或石腊油覆盖，PCR程序如下：/n1cycle:94℃，5min；/n30cycle:94℃，1min；50～63℃，1min；72℃，1min；/n1cycle:72℃，5min；/nstore:4℃；/nD、荧光定量体系的构建：/n荧光定量反应体系为20μl，组成如下：/n50ng/μl总DNA 1μl，10μl 2×HieffTM qPCR SYBR@Green Master Mix，10pM的引物F0.8μl，10pM的引物R 0.8μl，去离子无菌水7.4μl；/nE、细胞器基因组重复序列重组构象检测与分析：/n(1)统计PCR检测材料的扩增带，分析重复序列不同构象的有无，从而定性检测重复序列在不同品种中的差异；/n(2)通过荧光定量获得不同重复序列构象的Ct值，从而定量检测不同品种中重复序列不同构象含量的差异；/n(3)根据细胞器基因组重复序列重组产生的不同构象及其含量差异，快速区分不同来源的细胞质类型。/n