[发明专利]一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法

摘要

本发明公开的属于生物细胞技术领域，具体为一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法，S1：培养人包皮成纤维细胞(HFFs)：①将儿童术后包皮置于F12完全培养基(95％DMEM/F12和5％PS)；②在超净工作台中将包皮剪开铺展，1％PS的PBS洗两遍，用眼科剪除去皮下脂肪组织，剪成3mmˉ3mm大小，0.2％中性蛋白酶覆盖4℃过夜；S2：将HFFs重编程为神经细胞，本方法～1KPa的I型胶原基质(Collagen type I，Col)可以促进人成纤维重编程为成熟神经细胞；可以获得接近100％Tuj1⁺的神经细胞，效率高；10天即可获得表达SYN的成熟神经细胞，时间短。

主权项

1.一种将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法，其特征在于：该将人成纤维细胞高效大量重编程为成熟神经元的方法具体步骤如下：S1：培养人包皮成纤维细胞(HFFs)：①将儿童术后包皮置于F12完全培养基(95％DMEM/F12和5％PS)；②在超净工作台中将包皮剪开铺展，1％PS的PBS洗两遍，用眼科剪除去皮下脂肪组织，剪成3mm×3mm大小，0.2％中性蛋白酶覆盖4℃过夜；③用眼科镊将真皮和表皮撕开，弃掉表皮，将真皮放入低黏附培养皿，加入少量培养基，剪碎，0.2％I型胶原酶37℃消化6h，用80目筛网过滤；④使用1500rpm离心机离心5min，用PBS洗两遍；⑤HFM培养基(90％DMEM，10％FBS，1％NEAA，1％PS和0.5％GlutaMAX)培养；S2：将HFFs重编程为神经细胞：①将HFFs培养至第三代融合至90％以上后，消化计数，将细胞重悬于HFM培养基中暂时保存，并将密度调整为1×10⁶/ml的细胞悬液；②在冰浴条件下，在1.5mlEP管中依次加入以下成分：用枪混匀，并取HFM培养液167ul，加入上述成分中混合，取250ul混合液加入至24孔板的一个孔，37℃孵育30min以上，成胶后加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，小分子组0.1％Gelatin包被1h吸干后直接加入472ul HFM培养液和28ul细胞悬液，八字混匀，培养过夜；③第二天将Soft组和Stiff组换液为IM培养基(48.15％DMEM/F12，48.15％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为IMT培养基(IM培养基，0.5mM VPA，3uM CHIR99021，1uM Repsox，10uM Forskolin，10uM SP600125，5uM Go6983和5uM Y27632)，诱导4天，再换一次液；④继续诱导3天，将Soft组和Stiff组换液为MM培养基(48％DMEM/F12，48％Neurobasal，1％B27，0.5％N2，1％(10mM)cAMP，0.2％(10ug/ml)bFGF，0.2％(10ug/ml)BDNF，0.2％(10ug/ml)GDNF，0.2％(10ug/ml)NT3和1％PS)，将VCRFSGY组，Soft+VCRFSGY组和Stiff+VCRFSGY组换液为MMT培养基(MM培养基，3uM CHIR99021，10uM Forskolin和1uM Dorsomorphin)，继续培养3天，诱导完成。