[发明专利]一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用

摘要

本发明公开了一种miR‑21‑5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用，属于生物技术领域，筛选在母猪中显著高表达的miR‑21‑5p并推测其参与母猪的繁殖过程，并利用生物信息学技术确定Smad7基因为miR‑21‑5p调控的靶基因。本发明以母猪为研究对象，研究miR‑21‑5p和Smad7对pGCs凋亡的影响，以期阐明miR‑21‑5p和Smad7对卵泡发育的调控作用，并检测miR‑21‑5p对Smad7的调控作用，为提高母猪产仔率提供了有力的科研借鉴。本发明还公开了所述miR‑21‑5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法在提高母猪产仔率过程中的应用。

主权项

1.一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1、猪卵巢颗粒细胞培养/n(1)采样：提取猪卵巢的组织样本，用PBS缓冲液消毒灭菌处理，之后运回试验室进行试验研究；/n(2)清洗样品：首先采用75％酒精进行消毒清洗卵巢组织，同时将部分的卵巢放于固定液中，便于切片制作；/n(3)收取卵泡液：用10ml的针管吸取卵泡液，放入DMEM高糖培养液中；/n(4)离心：将上述(3)中的混合液放置于10ml离心管中，放入离心机中，转速：1000r/min，时间：10min，离心后弃去上清液；/n(5)接种：采用DMEM完全培养基，培养基成分为：85％DMEM高糖培养液+14％胎牛血清+1％双抗，重悬细胞，CO₂培养箱中培养；/n(6)去除杂质：培养24h后，用PBS缓冲液清洗杂质，细胞换液，继续培养；/n步骤2、化学合成miRNA模拟物和siRNA/n根据miRBase和GenBank数据库提供的猪miR-21-5p和Smad7的序列信息，体外化学合成miRNA模拟物、抑制剂和siRNA；合成的RNA小片段由苏州吉玛基因股份有限公司设计合成；合成序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：8所示；/n步骤3、pGCs的转染/n(1)将待接种pGCs放在6孔板上，培养24h，更换无双抗培养液，培养6h；/n(2)将10μL miR-21-5p mimics、miR-21-5p mimics-NC、miR-21-5p inhibitor、miR-21-5p inhibitor-NC和Smad7-siRNA-NC/288/536/1055分别溶于300μL opti-mem无血清培养基中，混匀，室温静置10min；/n(3)将10μL lipo3000溶于300μL opti-mem无血清培养基中，混匀，室温放置5min；/n(4)将(2)与(3)的试管溶液混合并静置30min；/n(5)6孔板的溶液用opti-mem无血清培养液更换，然后把混合溶液加入6孔板中，培养6h，用DMEM高糖培养基继续培养；/n步骤4、qRT-PCR检测/n(1)RNA提取/n(2)反转录/n根据TaKaRa反转录试剂盒说明书，构建反转录体系；/n(4)设计引物/n引物设计由苏州吉玛基因股份有限公司负责合成；合成的引物序列如SEQ：ID：NO：9-SEQ：ID：NO：10所示；/n(4)确定最适Tm值/n根据设计引物的退火温度，设置退火温度范围，反应条件如下：/n /n取12μL反应产物，凝胶电泳30min，寻找条带中最清晰，则其的温度就是退火温度即最适Tm值；/n(5)qRT-PCR/n根据说明书构建反应体系；反应条件设置为：变性条件下95℃ 60sec，延伸条件下95℃10sec，最适Tm值60sec，总共进行30次；以GAPDH作为内参，每个样品设置3个重复；/n(6)结果处理/n采用法计算相对表达量，进行3次重复试验，使用SPSS 21.0对数据结果进行研究分析，并进行显著性检验；/n步骤5、细胞凋亡检测/n参照细胞凋亡检测试剂盒的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；/n(1)GCs接种6孔板，将mimics NC、miR-21-5p mimics、inhibitor NC、miR-21-5pinhibitor、Smad7-siRNA-NC和Smad7-siRNA-1055分别转染到GCs中，DMEM高糖培养基培养24h；/n(2)吸取细胞液用缓冲液清洗一次，然后加入胰酶进行消化，再加入DMEM高糖培养基，吹打混匀，放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min；/n(3)弃掉上清，用1ml PBS缓冲液重悬细胞并计数，数量不少于1×10⁵，放入离心机进行离心，转速：1200r/min，时间：8min，然后收集细胞；/n(4)加入500μL的1×Binding buffer洗涤细胞一次，然后离心，转速：1200r/min，时间：8min，弃去上清液，再加入500μL 1×Binding buffer重悬细胞；/n(5)加入10μL的Annexin V-FITC，吹打混匀，室温静置20min；/n(6)加入15μL的PI染液，混匀，在冰盒中静置10min；/n(7)用流式细胞仪进行检测；/n(8)试验重复3次，对3次试验的细胞凋亡率，细胞凋亡率＝早期细胞凋亡率+晚期细胞凋亡率，用SPSS 22.0分析显著性差异；/n步骤6、细胞周期检测/n参照细胞周期检测试剂盒的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；/n(1)细胞消化后用PBS洗涤一次，离心1200r/min，8min，去上清，加入1mL的75％乙醇固定于-20℃；/n(2)取固定好的细胞进行离心，转速：1200r/min，时间：8min，用PBS洗涤一次，1200r/min，8min；/n(3)加入100μL的RNAase重悬细胞，37℃，30min；/n(4)加入400μL的PI染液，置4℃，30min，上机检测；/n(5)试验重复3次，对3次试验的细胞周期；细胞增殖指数(PI)＝(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100％；用SPSS 22.0分析显著性差异；/n步骤7、细胞增殖检测/n参照MTT检测试剂盒的操作说明书，具体操作步骤如下：pGCs培养和转染参照步骤1和步骤3；/n(1)将接种细胞放在96孔板，每孔添加150μL的opti-mem无血清培养液；/n(2)设置空白组和调零组，每间隔12h进行转染一次；/n(3)每孔添加20μL的MTT溶液，混匀，37℃的CO₂箱中培养6h；/n(4)弃去孔内溶液，在每孔中添加200μL的DMSO溶液，摇晃10min，使结晶充分溶解；/n(5)使用多功能酶标仪进行酶联免疫检测分析；/n(6)试验重复3次，对3次试验的细胞增殖率用SPSS 22.0分析显著性差异；/n步骤8、雌二醇和孕酮含量检测/npGCs转染后收取细胞培养液中的上清部分，在-20℃冰箱里储存，用于检测pGCs中E2和P的含量；采用武汉基因美公司生产的ELISA检测试剂盒，检测E2和P的浓度，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行；/n步骤9、构建靶基因双荧光素酶报告载体/n首先采用生物信息学方法，依靠miR-21-5p 5'端的第2-8位碱基与目的基因的3'UTR区序列之间碱基互补配对的原则，运用RNAhybrid 2.1.2软件，对miR-21-5p和目的基因的结合位点进行预测；/n利用全基因合成的方法合成Smad7基因3'UTR的野生序列和包含3'UTR突变位点的序列；同时，在这两个序列的5'端和3'端分别加装酶切位点酶切位点sgfI：GCGATCGC和XhoI：CTCGAG，二者的序列如SEQ：ID：NO：11-SEQ：ID：NO：12所示；/n随后，把合成的两个序列克隆到pmiR-RB-REPORTTM载体中；经过广州市锐博生物科技有限公司的测序后，确定获得了正确的重组载体；/n步骤10、双荧光素酶报告系统检测/n双荧光素酶报告基因活性检测参照广州市锐博生物科技有限公司的Dual-LuciferaseReporter Assay System试剂盒，具体操作步骤如下：/n293T细胞培养/n(1)DMEM完全培养基配制：85％DMEM高糖培养液+14％胎牛血清+1％双抗；/n(2)293T细胞复苏：从液氮罐中取出装有293T细胞的冻存管，快速放置于的37℃的恒温水浴锅中，使冻存管内的293T细胞融化之后，送到细胞间离心，设置转速1200r/min，时间8min，弃掉上清液，并加入DMEM完全培养基，混匀后用移液枪吸取适量293T细胞移入培养皿中，吹打混匀后，放入37℃的恒温箱中；/n(3)293T细胞传代：待培养皿中的293T细胞的密度达到85％，弃去培养液，并使用PBS缓冲溶液清洗1次，之后加入1ml的胰酶，放入37℃的恒温箱中消2min，再加入3ml的DMEM完全培养基终止消化，用移液枪吸取混合液至10ml离心管中，1200r/min离心8min，弃去上清液，再加入DMEM完全培养基，重新悬浮293T细胞，转移至24孔板内，最后放入37℃的CO₂培养箱中继续培养；/n293T细胞转染/n按照3000转染步骤进行：/n(1)转染前换成不含有双抗的培养液进行培养；/n(2)每个孔转染方式如下：/nA将1μg的质粒和100pmol的miR-21-5p mimics、mimics-NC溶于60μL的opti-mem无血清培养液中，静置8min；/nB将3μL的转染试剂溶于60μL的opti-mem无血清培养液中，静置8min；/nC将A液和B液混合，静置15min；/n(3)静置后，倒去细胞培养液，并加入500μL的opti-mem无血清培养液；/n(4)加入每孔中，放入37℃的CO2培养箱中培养5h，最后将opti-mem无血清培养液换成DMEM完全培养基再次进行培养24h；/n荧光素酶检测/n(1)裂解细胞：细胞培养24h之后，弃去培养液，用PBS缓冲溶液清洗2次，每次10min，再加入细胞裂解液150μL，摇晃振荡反应20min，用移液枪吹打，充分裂解细胞，然后置于离心机中，转速：1200r/min，时间：8min，吸取上清液备用；/n(2)将荧光素酶试剂和缓冲液溶解到试管中，并达到室温，萤光素酶检测底物置于冰盒上备用；/n(3)每个样品需150μL，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照l：150加入海肾萤光素酶检测底物配制成海肾萤光素酶检测工作液；/n(4)开启多功能酶标仪，测定间隔设为3sec，测定时间设为12sec；/n(5)每个样品取100μL进行检测；/n(6)加入150μL海肾萤光素酶检测工作液，用移液枪吹打均匀，之后测定相对荧光值；/n(7)用萤火虫萤光素酶为内参，不同样品间的荧光活性＝海肾萤光素酶的相对荧光值÷萤火虫萤光素酶的相对荧光值；/n步骤11、Western blot/n(1)蛋白提取/n(2)Western blot/n(3)结果处理/n图片使用Photoshop CS6软件进行裁剪，灰度用Quantity One v4.6.6软件进行分析，数据用SPSS 22.0分析显著性差异。/n